HPLC-DAD法同時測定理沖生髓飲中7種親脂性成分

王艷宏， 尚冬雪， 李 洋， 趙永偉， 張 艷， 韓鳳娟*

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱150040）

［質 量］

HPLC-DAD法同時測定理沖生髓飲中7種親脂性成分

王艷宏1， 尚冬雪1， 李 洋1， 趙永偉1， 張 艷2， 韓鳳娟2*

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱150040）

目的建立RP-HPLC法同時測定理沖生髓飲中親脂性成分的分析方法。方法理沖生髓飲超臨界萃取，HPLC法分析采用Dikma Diamonsi1-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以0.1%磷酸水溶液-乙腈為流動相梯度洗脫，體積流量為1 mL/min，檢測波長210 nm。結果姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯分別在0.16～8.14μg/mL、0.27～13.44μg/mL、0.10～4.98μg/mL、0.18～9.10μg/mL、0.08～4.06μg/mL、0.21～10.59μg/mL、0.28～14.18μg/m L范圍內線性關系良好。平均加樣回收率在96.76%～100.38%之間。結論本方法能夠準確測定理沖生髓飲7種親脂性成分。

理沖生髓飲；姜黃素；莪術醇；牻牛兒酮；莪術二酮；呋喃二烯；β-欖香烯；亞油酸

理沖生髓飲是國家老中醫、黑龍江省名中醫王秀霞教授在長期臨床實踐基礎上總結而成的中藥復方制劑，由莪術、三棱、黃芪、鹿茸等八味中藥組成，具破血消癥、軟堅散結、補氣養血、填精益髓之功，對卵巢癌的治療有獨特的療效［1］。現代實驗研究表明其既可以阻斷Bc1-2癌基因蛋白的表達［2］，又能夠降低卵巢腫瘤細胞的PCNA和P53基因的表達［3］，通過調節癌基因信號傳導，抑制細胞增殖［4］，進而抑制血管生成，在提高機體免疫的同時，促進癌細胞凋亡［5-7］。姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯是莪術的主要成分，具有消炎、抗血栓、抗腫瘤、抗菌抗病毒等多種藥理活性［8-12］。亞油酸是黃芪、鹿茸等均含有的成分，不僅對血管及血液中引起動脈粥樣硬化、血稠和栓塞的物質具有重要影響，而且還具有抗癌作用［13］。為了更好地控制產品質量，保證臨床療效，本實驗采用HPLC-DAD法對該制劑中的上述7種親脂性成分進行了定量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，2996型二極管矩陣檢測器，Empower工作站（美國Waters公司）；AB265-S型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；CHA121-50-01超臨界萃取裝置（南通華安超臨界萃取有限公司）；FW177中草藥粉碎機 （天津泰斯特儀器有限公司）；GZX-9240型數顯鼓風干燥箱 （上海博迅醫療設備廠）。

1.2 試藥 對照品姜黃素 （批號 110823-201004），莪術二酮 （批號111800-201001），莪術醇 （批號100185-201007），牻牛兒酮 （吉馬酮）（批號111665-201204），呋喃二烯 （批號111824-201102），亞油酸 （批號111622-201203），β-欖香烯 （批號100268-201402），均購自中國藥品生物制品檢定所。無水乙醇、磷酸 （分析純，天津富宇精細化工），乙腈（色譜純，美國Sigma-A1drich公司），屈臣氏蒸餾水。復方理沖生髓飲方中各藥由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院提供，經黑龍江中醫藥大學孫慧峰教授鑒定均符合 《中國藥典》2010年版各項下藥材規定。

2 方法與結果

2.1 理沖生髓飲的制備 取處方量的藥材，適當粉碎，以超臨界萃取 （SCFE）法萃取，獲得萃取物；藥渣繼續以75%乙醇回流提取，提取液回收乙醇后濃縮至適量；藥渣揮盡溶劑后，繼續以水回流提取，水提液濃縮后，與上述濃縮液合并，加入萃取物，攪勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 精密吸取理沖生髓飲適量，減壓旋干溶劑后，加無水乙醇超聲溶解，并定容至50 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備 分別取對照品姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯適量，精密稱定，加無水乙醇分別制成每1 mL含姜黃素407.0μg、莪術二酮672.0 μg、莪術醇248.8μg、牻牛兒酮455.2μg、呋喃二烯203.0μg、亞油酸529.5μg、β-欖香烯709.0 μg的溶液作為各對照品貯備液，再分別吸取各對照品貯備液5.0 mL置50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度作為對照品混合溶液。

2.4 陰性對照液的制備 按 “2.1”項理沖生髓飲的制備方法分別制備缺莪術、缺黃芪、鹿茸的樣品；按 “2.2”項供試品溶液的制法制備陰性對照液。

2.5 色譜條件 色譜柱為Dikma Diamonsi1-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為0.1%磷酸水溶液 （A）-乙腈 （B）梯度洗脫 （0～15 min，45%→60%B；15～25 min，60%→70%B；25～35 min，70%B；35～50 min，70%→88%B；50～58 min，88%→90%B；58～68 min，90%→95%B；68～75 min，95%→100%B）。柱溫30℃，體積流量1 m L/min，進樣量10μL，檢測波長210 nm。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系的考察 按逐級稀釋法，分別精密吸取上述對照品混合溶液0.1、0.5、1、3、5 mL于25 mL量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，得混合對照品系列溶液，按 “2.5”項下色譜條件進行測定，以峰面積 （Y）對質量濃度 （X）進行線性回歸，得到7種成分的回歸方程分別為Y= 7 977.5X+5 038，r=0.999 7；Y=1 310.8X+ 14 055，r=0.999 7；Y=3 714.4X+20 810，r= 0.999 5；Y=8 327.2X+9 517.5，r=0.999 6；Y=28 336X+22 994，r=0.999 8；Y=19 224X+ 27 857，r=0.998 5；Y=7 270.4X+2 423.5，r= 0.999 5。姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯分別在0.16～8.14 μg/mL、0.27～13.44μg/m L、0.10～4.98 μg/mL、0.18～9.10μg/mL、0.08～4.06μg/mL、0.21～10.59μg/mL、0.28～14.18μg/m L范圍內線性關系良好。

2.6.2 系統適應性 取陰性對照液、混合對照品溶液和供試品溶液，按 “2.5”項下色譜條件測定，各對照品色譜峰與其左右干擾峰分離度在1.5～5.3之間，姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的保留時間分別為8.359、17.208、24.694、29.899、44.328、 51.314、58.622 min，理論塔板數均大于7 000，如圖1所示。

圖1 理沖生髓飲HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of Lichong Shengsui Drink

2.6.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，重復進樣6次，每次進樣10μL，測得姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的峰面積，其RSD分別為0.54%、0.48%、0.63%、0.77%、0.87%、0.95% 和0.69%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩定性試驗 取已配制好同一供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12、24 h注入色譜儀，計算各組分色譜峰的峰面積RSD，測得姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的RSD值分別為1.05%、0.99%、1.31%、1.18%、1.43%、1.42%和1.08%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.5 重復性試驗 精密吸取理沖生髓飲適量，按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，按 “2.5”項色譜條件測定，進行6次平行試驗，結果姜黃素、莪術二酮、莪術醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的質量分數的RSD值分別為1.83%、 1.91%、 1.69%、 1.77%、 1.95%、1.83%和1.76%，表明方法重復性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗 精密吸取已知各成分含有量的理沖生髓飲10 m L 9份，按其中所含各成分的80%、100%和120%質量分別精密加入對照品混合溶液0.8、1.0、1.2 mL，按 “2.2”項下方法制備成供試品溶液，按 “2.5”項下色譜條件分別測定。結果見表1～7。

表1 姜黃素加樣回收率Tab.1 Resu lts of recovery tests for curcum in

2.7 樣品測定 精密吸取3份不同批供試品溶液，按 “2.5”項下色譜條件分別測定，將峰面積帶入上述線性回歸方程計算，得各組分質量分數，見表8。

表2 莪術二酮加樣回收率Tab.2 Results of recovery tests for curdione

表3 莪術醇加樣回收率Tab.3 Results of recovery tests for curcumol

表4 牻牛兒酮加樣回收率Tab.4 Resu lts of recovery tests for germacrone

表5 呋喃二烯加樣回收率Tab.5 Results of recovery tests for furanodiene

表6 亞油酸加樣回收率Tab.6 Results of recovery tests for linoleic acid

表7 β-欖香烯加樣回收率Tab.7 Results of recovery tests forβ-elem ene

表8 理沖生髓飲中7種成分的測定結果Tab.8 Determ ination of seven constituents in Lichong Shengsui D rink

3 討論

中藥制劑質量控制的模式正由單指標向多指標，由單成分向大類成分 （有效部位）質量控制模式轉變。理沖生髓飲中的揮發油類、皂苷類、黃酮類、多糖類成分等均為其治療卵巢癌的物質基礎［8-13］。我們試圖建立一種能夠同時測定這些類成分的高效液相分析方法，但由于這些成分理化性質差異較大，供試品溶液的制備、流動相的組成、檢測器的要求等很難統一，因此，只能分別建立定量測定方法。

本實驗分別對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%醋酸水溶液系統梯度洗脫的分離效果進行了考察，結果發現，甲醇-水與乙腈-水系統嚴重拖尾，分離效果較差；而乙腈-0.1%甲酸水溶液與乙腈-0.1%醋酸水溶液紫外末端吸收較大，基線漂移，影響色譜圖檢識；乙腈-0.1%磷酸水溶液能夠將各組分分離，且峰形較好，基線平穩，因而選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液系統進行梯度洗脫。

本實驗采用二極管陣列檢測器在190～400 nm范圍內全波長掃描，對203 nm、210 nm、216 nm和220 nm波長下的色譜圖進行分析比較，結果顯示，供試品在210 nm處能夠將各組分檢出，且各峰之間分離度較好，因此選擇210 nm作為檢測波長。

本實驗所建立的方法簡單、準確、可靠，可同時測定理沖生髓飲中姜黃素、莪術醇、牻牛兒酮、莪術二酮、呋喃二烯、β-欖香烯及亞油酸等7種親脂性成分，從而為理沖生髓飲的質量標準的制定提供了依據，并為該方進一步開展治療卵巢癌藥效物質基礎及作用機制研究奠定了基礎。

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Sim ultaneous determ ination of seven lipophilic constituents in Lichong Shengsui Drink by HPLC-DAD

WANG Yan-hong1， SHANG Dong-xue1， LI Yang1， ZHAO Yong-wei1， ZHANG Yan2，HAN Feng-juan2*
（1.Heilongjiang University ofChineseMedicine，Harbin 150040，China；2.FirstAffiliated Hosital，Heilongjiang University of ChineseMedicine，Harbin 150040，China）

AIMTo estab1ish an HPLC-DAD method for simu1taneous1y determining the contents of curcumin，curcumo1，cermacrone，curdione，furanodiene，β-e1emene and 1ino1eic acid in Lichong Shengsui Drink（LCSSD）.METHODSHPLC ana1ysis of LCSSD methano1ic extract was performed on Dikma Diamonsi1-C18（250 mm×4.6mm，5μm）co1umn with themobi1e phase of0.1%phosphoric acid aqueous so1ution as phase A and acetonitri1e as phase B in gradient e1ution manner.The vo1umetric f1ow rate was 1 mL/min and the detection wave1ength was set at210 nm.RESULTSEvery constituentwas separated perfect1y and good 1iner re1ationships between peak area and mass concentration were obtained in the ranges of 0.16-8.14μg/mL，0.27-13.44 μg/mL，0.10-4.98μg/mL，0.18-9.10μg/mL，0.08-4.06μg/mL，0.21-10.59μg/mL and 0.28-14.18μg/mL，respective1y.The average recovery ratewaswithin the ranges of96.76%-100.38%.CONCLUSIONThismethod is accurate and re1iab1e for the determination of above-mentioned seven 1ipophi1ic constituents in LCSSD.

Lichong Shengsui Drink（LCSSD）；curcumin；curcumo1；curdione；germacrone；furanodiene；β-e1emene；1ino1eic acid

R927.2

A

1001-1528（2015）08-1713-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.017

2014-10-30

國家自然科學基金項目 （81273788）

王艷宏（1972—），女，教授，碩士生導師，從事中藥性味理論和中藥制劑現代化研究。E-mai1：wang.yanhong@163.com

*通信作者：韓鳳娟 （1971—），女，教授，博士生導師，主要從事中西醫結合診治婦科腫瘤研究。E-mai1：hanfengjuan2004@163.com