HPLC法同時測定靈澤片中牻牛兒酮和呋喃二烯

朱方劍， 姚炳興， 林麗萍， 宋華麗

（浙江佐力藥業股份有限公司，浙江省真菌藥物工程技術研究中心，浙江湖州313200）

HPLC法同時測定靈澤片中牻牛兒酮和呋喃二烯

朱方劍， 姚炳興， 林麗萍， 宋華麗

（浙江佐力藥業股份有限公司，浙江省真菌藥物工程技術研究中心，浙江湖州313200）

目的建立HPLC法同時定量測定靈澤片 （烏靈菌粉、莪術、浙貝母、澤瀉）中牻牛兒酮和呋喃二烯。方法Dionex Acc1aim 120 C18色譜柱（4.6mm×250mm×5μm），流動相為乙腈和水，梯度洗脫；體積流量1.0mL/min；柱溫25℃；檢測波長216 nm；進樣量5μL。結果牻牛兒酮在2.21～44.24μg/mL的質量濃度范圍內呈良好的線性關系，平均回收率98.5%，RSD為1.6%；呋喃二烯在2.08～41.60μg/mL的質量濃度范圍內呈良好的線性關系，平均回收率97.3%，RSD為1.6%。結論本方法操作簡便，結果準確，可以替代GC法測定牻牛兒酮。

HPLC；靈澤片；牻牛兒酮；呋喃二烯

靈澤片于2011年被批準為中藥6類新藥，執行國家食品藥品監督管理局標準YBZ00902011。處方由烏靈菌粉、莪術、浙貝母、澤瀉組成，具有益腎活血、軟堅散結、利尿除濕的功效。用于前列腺增生腎虛血瘀濕阻證。癥見尿頻，排尿困難，尿線變細，淋漓不盡，腰膝酸軟。莪術為方中臣藥，主要含有揮發油。莪術揮發油中含有牻牛兒酮、呋喃二烯等倍半萜成分［1-4］，牻牛兒酮與呋喃二烯具有抗癌、抗菌、活血化瘀等藥理作用［5-8］，為莪術的主要藥效成分，為莪術油指紋圖譜參照物［9-10］，可以將溫莪術揮發油與蓬莪術、廣西莪術、郁金、姜黃等同屬植物的揮發油加以區別［11］。原質量標準中采用氣相色譜法測定本品中牻牛兒酮的量，本實驗采用高效液相色譜法［12］，同時測定靈澤片中牻牛兒酮和呋喃二烯的量，該方法簡便、準確、重復性好，可作為靈澤片的質量控制方法研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安U1timate 3000液相色譜儀（LPG-3400SD四元梯度泵，WPS-3000SL自動進樣器，VWD-3100紫外檢測器，Chrome1eon 6.8數據工作站），KQ-300型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司），BS224 S電子天平 （北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 試藥 牻牛兒酮 （批號111665-201103）和呋喃二烯 （批號111824-201102）對照品均購于中國藥品生物制品檢定院。靈澤片 （批號分別為20121001、20121002、20130401）由浙江佐力藥業股份有限公司提供。乙腈為色譜純，水為超純水（自制），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Dionex Acc1aim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5μm）。流動相為乙腈（A）-水 （B），梯度洗脫 （0～20 min，60%～95%A；21～35 min，95%A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長216 nm；柱溫25℃；進樣量5μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取牻牛兒酮對照品11.06 mg、呋喃二烯對照品10.40 mg，置100 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液 （Ⅰ）。精密量取混合對照品貯備液2 m L，置10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液 （Ⅱ），其中牻牛兒酮為22.12μg/mL，呋喃二烯為20.80μg/mL，用微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備 本品研細，取3.5 g，精密稱定，置500 m L圓底燒瓶中，加水200 mL，按揮發油測定法 （《中國藥典》2010年版一部附錄X D，側管中加乙酸乙酯2 mL），提取2次，每次2 h，合并乙酸乙酯液，轉移至25 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方及工藝制備不含莪術的樣品，再按 “2.3”項下制備成缺莪術的陰性樣品溶液。

2.5 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，分別按 “2.1”項下色譜條件測定，結果陰性樣品溶液對牻牛兒酮和呋喃二烯的測定無干擾，見圖1。

圖1 靈澤片HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s of Lingze Tablets

2.6 線性關系考察 精密量取 “2.2”項下混合對照品貯備液 （Ⅰ）0.2、0.5、1、2、3、4 mL，置10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，即得6個不同質量濃度的混合對照品溶液。按 “2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，以牻牛兒酮、呋喃二烯質量濃度為橫坐標，做線性回歸，得回歸方程，牻牛兒酮為y= 257.38x-0.031 5（r=0.999 9）；呋喃二烯為y= 255.79x-0.0144（r=0.999 8）。結果表明牻牛兒酮和呋喃二烯分別在2.21～44.24μg/mL和2.08～41.60μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 取 “2.2”項下制備的混合對照品溶液，按 “2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，記錄牻牛兒酮和呋喃二烯的峰面積，并計算它們的RSD值，分別為0.4%和0.4%，結果表明儀器的精密度良好。

2.8 重復性試驗 取同一批號的樣品 （批號20130401）6份，按 “2.3”項下的方法制備供試品溶液，于 “2.1”項色譜條件下測定，記錄峰面積，結果牻牛兒酮的RSD為0.8%，呋喃二烯的RSD為0.6%，表明該方法重復性好。

2.9 穩定性試驗 取同一供試品 （批號20130401）溶液，分別于配制后0、1、3、6和12 h在 “2.1”項色譜條件下測定，記錄峰面積，結果牻牛兒酮的RSD為0.4%，呋喃二烯的RSD為0.2%，表明供試品溶液在12 h內較穩定。

2.10 加樣回收率試驗 稱取已知牻牛兒酮和呋喃二烯含有量的供試品 （批號20130401）6份，每份約1.7 g，分別精密加入含牻牛兒酮1.447 mg/mL和呋喃二烯1.308 mg/mL（用乙酸乙酯溶解）的對照品溶液2 mL，按 “2.3”項制備供試品溶液后測定，結果見表1。

表1 2種活性成分的加樣回收試驗結果Tab.1 Results of recovery tests for two active com ponents

2.11 樣品測定 取3批靈澤片樣品，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，并在 “2.1”項色譜條件下測定峰面積，每批樣品測定3份，結果見表2。

表2 3個批次靈澤片中2種活性成分的測定Tab.2 Con tents of two active com ponents in three batches of Lingze Tablets

3 討論

3.1 提取方法的選擇 實驗中比較了回流提取和超聲提取兩種方法對靈澤片中牻牛兒酮和呋喃二烯定量測定的影響，結果采用超聲提取的方法測得的牻牛兒酮和呋喃二烯含有量遠遠低于回流提取的方法，因此選擇了回流提取的方法。

3.2 提取次數的選擇 實驗還對回流提取方法的提取次數進行了考察，結果兩次提取后，靈澤片中的牻牛兒酮和呋喃二烯已基本提取完全，故方法選擇提取兩次。

3.3 流動相的選擇 參考文獻，本實驗曾以甲醇-水［13］、乙腈-水［14］等系統的不同比例為流動相進行等度、梯度洗脫，結果以流動相乙腈 （A）-水（B），梯度洗脫 （0～20 min，60%～95%A，21～35 min，95%A）的分離效果最優。

3.4 檢測波長的選擇 呋喃二烯在216.5 nm波長處有最大吸收，牻牛兒酮在該波長處存在末端吸收，結合2010年版 《中國藥典》莪術油指紋圖譜項下的檢測波長，選擇216 nm為檢測波長。

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Sim ultaneous determ ination of germacrone and furanodiene in Lingze Tablets by HPLC

ZHU Fang-jian， YAO Bing-xin， LIN Li-ping， SONG Hua-1i

（Zhejiang Jolly Pharmaceutical Co.，Ltd，Fungus Drug Engineering Technology Research Center of Zhejiang Province，Huzhou 313200，China）

AIMTo estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of germacrone and furanodiene from Lingze Tab1ets（Wu1ing Myce1ia Powder，Curcumae Rhizoma，Fritillariae Thunbergii Bulbus，Alismatis Rhizoma）.METHODSThe ana1ysiswas carrierd outon Dionex Acc1aim 120 C18co1umn（4.6 mm× 250 mm×5μm）with acetonitri1e and water as the mobi1e phase and 1.0 mL/min of f1ow rate gradient e1ution manner，the co1umn temperature wasmaintained at25℃with 216 nm of detection wave1ength and 5μL injection vo1ume.RESULTSGermacrone in the concentration range of 2.21-44.24μg/mL showed a good 1inear re1ationship with 98.5%the average recovery and 1.6%RSD；furanodiene within the concentration range of 2.08-41.60μg/mL presented good 1inear re1ationship with 97.3%the average recovery and 1.6%RSD.CONCLUSIONThemethod is simp1e，accurate and can substitute for the GC quantitative determination of germacrone.

HPLC；Lingze Tab1et；germacrone；furanodiene

R927.2

A

1001-1528（2015）08-1727-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.020

2014-12-29

朱方劍 （1981—），男，工程師，從事藥物制劑及質量標準研究。Te1：（0572）8281963；E-mai1：zfjian@163.com