肺腺癌組織中基質窖蛋白-1和LDH-B、PKM2的表達及其意義

陳福春 潘琦 傅品 陸富年 陳洪雷

肺腺癌組織中基質窖蛋白-1和LDH-B、PKM2的表達及其意義

陳福春 潘琦 傅品 陸富年 陳洪雷

目的探討基質窖蛋白1（Cav-1）、乳酸脫氫酶B（LDH-B）和丙酮酸激酶2（PKM2）在人肺腺癌（PAC）組織中的表達并分析3者的相關性及其臨床意義。方法采用量子點免疫熒光組織化學（QDs-IHC）技術檢測68例PAC組織和16例非癌性肺組織中基質Cav-1、LDH-B和PKM2的表達情況。結果基質Cav-1在PAC組織的陽性率為58．8%，與非癌變肺組織的陽性率100%相比，差異有統計學意義（P＜0．05）。肺腺癌組織中LDH-B和PKM2的陽性率分別為76．5%、70．6%，均高于非癌性肺組織（均P＜0．05）。PAC中、低分化組PKM2的陽性率均高于高分化組（均P＜0．05）。結論基質Cav-1缺失，LDH-B、PKM2的高表達可能促進PAC的惡性進展。

肺腺癌 窖蛋白1 乳酸脫氫酶B 丙酮酸激酶2 腫瘤能量代謝

我國肺癌發病率總體上呈不斷上升的趨勢，其中非小細胞肺癌（NSCLC）的發病率約為80%，而肺腺癌（pulmonary adenocarcinoma，PAC）就占40%。PAC極易發生區域淋巴結和遠處轉移，發病率和病死率逐漸增高，所以尋找PAC的發病機制十分重要。微環境在腫瘤的形成、侵襲和轉移中發揮著重要作用，其中最重要的是成纖維細胞。成纖維細胞和腫瘤細胞相互作用后被活化，稱為癌相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs），可以促進腫瘤的生長和轉移[1]。窖蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是caveolins家族中重要的一員，對腫瘤的發生有促進和抑制雙重作用。近來研究發現，基質成纖維細胞中Cav-1表達的缺失可促使其活化為CAFs，并作為胃癌、結腸癌一項獨立的不良預后指標[2-3]。氧充足的條件下，腫瘤細胞糖酵解代謝同樣明顯活躍，稱為瓦博格效應[1]。基質Cav-1的缺失是否可以促進PAC的侵襲和轉移，以及它的機制是否通過上調需氧糖酵解的酶[丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）和左旋乳酸脫氫酶B（L-lactate dehydrogenase B，LDH-B）]仍然未知。本研究利用量子點免疫熒光組織化學（quantum dots immunofluorescent histochemistry，QDs-IHC）技術檢測基質Cav-1、LDH-B和PKM2在PAC組織中的表達并分析其臨床意義，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象和試劑 收集我院2007年1月至2011年1月手術切除后的PAC標本68例，其中非癌變肺組織16例。所有組織術前均未經放化療，經10%中性緩沖甲醛固定24h。68例PAC患者中男43例，女25例，年齡33～74，平均56.4歲。采用2009年國際抗癌聯盟（UICC）第7版肺癌TNM分期，Ⅰ期46例，Ⅱ期+Ⅲ期22例；伴淋巴結轉移的PAC組織17例，無淋巴結轉移的PAC組織51例；組織學分級為Ⅰ級27例，Ⅱ級+Ⅲ級41例。兔抗人Cav-1和PKM2多克隆抗體（美國CST公司，濃度分別為1∶400、1∶50），鼠抗人LDH-B單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，濃度為1∶100）；生物素化羊抗兔、鼠IgG（美國Vector公司，濃度均為1∶400）。量子點超敏熒光試劑盒（605nm QD標記的鏈霉親和素，605nm QDs-SA）購自武漢珈源量子點技術開發有限公司。

1.2 方法 QDs-IHC檢測蛋白表達參照文獻[5]，組織切片滴加90%甘油封片后，上熒光顯微鏡Olympus BX51（CCD DP72）藍光激發，以細胞內出現紅色的熒光顆粒為陽性。用TBS代替一抗作空白對照，用已知陽性片作陽性對照。觀察顯示基質Cav-1蛋白定位于胞膜和胞漿內，PKM2蛋白定位于胞漿內，而LDH-B定位于胞核內。基質Cav-1采用半定量評分方法：高倍鏡下每塊組織或每芯選3個視野，按基質CAFs陽性細胞所占百分比計分，陰性為0分，陽性細胞數≤30%為1分，陽性細胞數＞30%為2分，0分表示基質Cav-1表達缺失，1、2分表示基質Cav-1表達陽性[6]。腫瘤細胞LDH-B和PKM2采用半定量評分方法[7]，高倍鏡下每塊組織或每芯選3個視野，每個視野計數100個腫瘤細胞。先按染色強度計分：無色為0分，淡紅色為1分，紅色為2分，亮紅色為3分；再按陽性細胞所占百分比計分：陽性細胞數1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，陽性細胞數＞75%為4分，兩種積分相乘≥2判為免疫熒光組織化學陽性表達。1.3 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗和四格表精確概率法，基質Cav-1與LDH-B、PKM2之間的相關性采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 基質Cav-1的表達情況 基質Cav-1主要表達于正常肺泡上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和脂肪細胞等，在腫瘤的CAFs和腫瘤細胞中也有部分表達，見圖1、2。68例PAC組織中基質Cav-1表達的陽性率為58.8%，與非癌變肺組織相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。Cav-1表達陽性率與PAC臨床病理參數均無關（均P＞0.05），詳見表1。

圖1 Cav-1在肺腺癌腫瘤細胞陽性表達，基質陰性

表1 Cav-1在PAC中的表達及與臨床病理參數的關系[例（%）]

2.2 LDH-B、PKM2蛋白的表達情況 LDH-B蛋白主要表達在癌細胞的胞核和胞質，基質也有少量表達，而在癌旁正常組織中幾乎不表達，見圖3。PKM2蛋白主要表達于癌細胞的胞質內，在癌旁正常組織中幾乎不表達，在腫瘤周圍的CAFs中也有部分表達，見圖4。68例PAC組織中LDH-B蛋白表達的陽性率為76.5%，PKM2表達的陽性率為70.6%，與非癌變肺組織（18.8%、12.5%）相比，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。LDHB的表達與PAC的臨床病理參數均無關（均P＞0.05）；PKM2在PAC中、低分化組和高分化組的陽性率分別為80.5%和55.6%，差異有統計學意義（P＜0.05）；與其余的臨床病理參數均無關（均P＞0.05），詳見表2。

2.3 基質Cav-1、LDH-B和PKM2蛋白表達之間的相關性 Cav-1陽性而腫瘤細胞LDH-B陰性8例，Cav-1陰性而腫瘤細胞LDH-B陽性20例，兩者無顯著相關性（r=0.099，P＞0.05）。基質Cav-1陽性而腫瘤細胞PKM2陰性11例，基質Cav-1陰性而腫瘤細胞PKM2陽性19例，兩者無顯著相關性（r=0.050，P＞0.05）。腫瘤細胞中PKM2和LDH-B共同陽性10例，共同陰性14例，兩者無顯著相關性（r=0.098，P＞0.05）。

圖3 LDH-B在肺腺癌腫瘤細胞陽性表達，基質陰性

圖4 PKM-2在肺腺癌腫瘤細胞陽性表達

表2 LDH-B和PKM-2在PAC中的表達及與臨床病理參數的關系[例（%）]

3 討論

PAC的進展以及侵襲轉移和許多因素有關，涉及腫瘤細胞和周圍復雜微環境的相互作用。因此，深入研究PAC侵襲轉移的分子機制，尋找新的特異的分子標志物對PAC進行早期診斷與治療十分重要。

3.1 基質Cav-1在PAC中的表達和臨床意義 Caveolin家族有3個成員，Cav-1、Cav-2和Cav-3。Caveolins均參與細胞吞噬，信號轉導及膽固醇運輸等。其中Cav-1是最重要的結構和功能組分，通過脂質轉運、細胞膜運輸、基因調節和信號轉導等在腫瘤形成中發揮著重要作用[8]。近年研究發現，腫瘤微環境中成纖維細胞可以促進腫瘤的侵襲和轉移，成纖維細胞中Cav-1的缺失是其中一項可能的機制[2]。本研究顯示，基質Cav-1蛋白在PAC組織中的陽性表達率顯著低于對照組，表明在PAC的惡性進展中，基質Cav-1的缺失發揮了重要作用，這與El-Gendi等[9]和Di Vizio等[10]在乳腺癌和前列腺癌中的研究結果部分一致。基質Cav-1表達的陽性率與PAC的臨床病理參數均無關，可能與研究的病例數較少有關。Goetz等[11]通過三維培養證實基質Cav-1表達有助于腫瘤細胞的延伸，在腫瘤轉移部位表達明顯增加，并且與腫瘤的不良預后有關。Sun等[12]在73例宮頸癌的研究中發現，基質Cav-1的缺失和宮頸癌的臨床病理學參數無關，結合我們的結果，提示基質Cav-1的缺失還不能作為所有上皮性腫瘤的預后指標，可能也與腫瘤的組織學類型有關，需要進一步通過多種途徑進行研究。

3.2 LDH-B在PAC中的表達和臨床意義 丙酮酸鹽既是糖酵解的產物，又是三羧酸循環的原料，是許多不同代謝途徑的樞紐。真核生物中，乳酸脫氫酶（LDHs）是由兩型亞基（M型和H型）構成的四聚體，催化丙酮酸鹽和乳酸鹽之間的可逆反應。LDH-B基因編碼H型亞基；LDH-A是HIF-1的靶基因，編碼M型亞基。這兩型亞基以不同的比例組成 5種同工酶：LDH1～LDH5。LDHs和腫瘤關系密切，伴有血清LDHs增高的患者預后較差。本研究顯示，LDH-B蛋白在PAC組織中的陽性表達率顯著高于對照組，表明LDH-B蛋白表達上調可能促進PAC的惡性進展。本研究發現，LDH-B蛋白的陽性率和PAC患者的臨床病理參數均無顯著相關性。LDH-B（存在于LDH-1）的功能主要是將乳酸鹽轉變為丙酮酸鹽。Ubaldo等[13]發現糖酵解的終產物丙酮酸鹽可以促進腫瘤的生長和轉移。結合本實驗結果和以往的報道[14]，可推測腫瘤細胞（非CAFs）中LDH-B表達增強可能與PAC的侵襲和轉移有關，需要擴大病例繼續研究。

3.3 PKM2在PAC中的表達和生物學意義 丙酮酸激酶是糖酵解過程的一個限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）去磷酸化為丙酮酸鹽從而產生ATP。丙酮酸激酶有4個亞型：PKM1、PKM2、PKL和PKR，分別表達于不同的細胞類型[15]。腫瘤形成過程中，PKM1、PKL和PKR被PKM2所取代。許多腫瘤細胞中PKM2的表達上調，如乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、口腔鱗癌和結腸癌等[15-18]。PKM2可以協同HIF-1促進需氧糖酵解和腫瘤血管生成[19]。本研究顯示，PKM2蛋白在PAC組織中的陽性率顯著高于對照組，表明PKM2蛋白表達上調可能促進PAC的惡性進展。PKM2蛋白在PAC中、低分化組和高分化組的陽性率分別為80.5%和55.6%，差異有統計學意義，表明PKM2蛋白高表達預示PAC分化不良，與在口腔鱗癌中的報道類似，并可作為不良預后的指標[17]。據此推測，丙酮酸鹽可以促進PAC的生長和轉移，依據可能是腫瘤細胞中PKM2的高表達。

3.4 基質Cav-1、LDH-B、PKM2在PAC中的關系 Bonuccelli等[13]建立的人異種移植動物模型及免疫組化中也發現，Cav-1缺失的CAFs中LDH-B和PKM2的表達上調，這個模型也符合經典的瓦博格假說。本研究顯示，基質Cav-1、LDH-B、PKM2彼此之間均無顯著相關性，需要擴大病例繼續研究。在以往的報道中，隨著基質Cav-1表達降低，基質中LDH-B和PKM2表達增強，表明PAC中存在逆轉的瓦博格效應[14]。

腫瘤是一種代謝性疾病，需用有限的資源產生足夠的能量滿足腫瘤細胞的增殖和轉移，這就需要進行需氧糖酵解。而CAFs中的需氧糖酵解相當于一個工廠，不斷為腫瘤細胞的增殖提供能量。總之，基質Cav-1缺失、腫瘤細胞LDH-B和PKM2高表達，可能促進肺腺癌的惡性進展。

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Expression of stromal caveolin-1,LDH-B and PKM2 in pulmonary adenocarcinoma

ObjectiveTo investigate the expression of stromal caveolin-1(Cav-1),L-lactate dehydrogenase B (LDH-B)and pyruvate kinase M2(PKM2)in pulmonary adenocarcinoma(PAC)tissues．MethodsThe expression of stromal Cav-1,LDH-B and PKM2 proteins in 68 specimens of PAC and 16 specimens of noncancerous lung tissue with quantum dots immunofluorescent histochemistry(QDs-IHC),ResultsThe positive rates of stromal Cav-1 in PAC tissues and non-cancerous lung tissues were 58．8%and 100．0%(P＜0．05)．The positive rates of LDH-B and PKM2 expression in PAC tissues were 76．5% and 70．6%,respectively,which were higher than those in noncancerous lung tissues(P＜0．05)．The expression of PKM2 in middle/low-differentiated PAC was higher than that in well-differentiated PAC(P＜0．05)．ConclusionThe results indicated that stromal Cav-1 is down-regulated and LDH-B and PKM2 are up-regulated in pulmonary adenocarcinoma．

Pulmonary adenocarcinoma Caveolin-1 L-lactate dehydrogenase B Pyruvate kinase M2 Tumor energy metabolism

2015-04-10）

（本文編輯：田云鵬）

國家自然科學基金資助項目（編號：30500226）

317500 溫嶺市中醫院胸外科（陳福春、潘琦、陳洪雷）；武漢大學基礎醫學院病理學教研室（傅品、陸富年）