補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞黑素合成及ER/MAPK 信號通路的影響

劉國良 于英君 姚 遠 姜 穎 張 寧 張明磊 高海娜 李建民

黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040

黃褐斑俗稱蝴蝶斑，是黑素細胞（melanocytes，MC）合成黑素量過多蓄積于皮膚而形成的，研究發現機體內雌激素水平與黃褐斑的發病關系密切，雌激素與雌激素受體結合可影響黑素細胞增殖、黑素合成關鍵酶酪氨酸酶（TYR）的活性及數量，從而影響黑素合成，是導致色素沉著的主要因素[1-4]。在天然植物中發現許多有弱雌激素樣作用化合物， 可與雌激素受體（ER）相結合發揮雌激素樣作用， 用于治療激素相關疾病。植物雌激素又被稱為選擇性雌激素受體調節劑，其雌激素活性較雌二醇低，表現出具有類雌激素或抗雌激素效應，故而在體內具有較溫和的雙向調節作用[5-7]。植物雌激素與ER 結合后，刺激性激素結合球蛋白的產生，并抑制TYR 和雌激素合成酶的活性，從而減輕雌激素促細胞增殖的作用，而植物雌激素在黑素合成過程中發揮怎樣的作用，以及其是如何通過ER 信號通路進行調控的還不得而知。本研究選用補骨脂中的植物雌激素成分補骨脂二氫黃酮甲醚作用于人黑素瘤細胞（A375 細胞），研究其對ER、MAPK 信號通路蛋白激酶表達的影響，闡明植物雌激素成分干預黑素合成的作用機制，為合理利用中藥植物雌激素防治黃褐斑等皮膚色素沉著類疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

補骨脂二氫黃酮甲醚（南京澤朗科技有限公司，批號：20130821）；HRP 標記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司，生產批號：BST08k13B）；小鼠抗人JNK 單克隆抗體（生產批號：#G0913）；ER 阻斷劑（ICI182780）（TOCRIS 公司，批號：20A/129473）；JNK 抑制劑（SP600125）（美國Selleck 公司，批號：S110202）。

1.2 細胞分組

將對數期生長的A375 細胞，以105每孔接種到6 孔板中，37℃、5%CO2培養。 實驗分為空白組（加入2 mL DMEM 完全培養液，培養72 h）、雌二醇組（A375 細胞培養24 h 后，加入雌二醇濃度為10-3μmol/L 的2 mL DMEM 完全培養液，繼續培養48 h）、補骨脂二氫黃酮甲醚組（A375 細胞培養24 h 后，加入不同濃度的補骨脂二氫黃酮甲醚2 mL 的DMEM 完全培養液，繼續培養48 h）、ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組（先加2 mL 的ICI182780培養2 h 后， 再加1 mL 補骨脂二氫黃酮甲醚，繼續培養48 h）、SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組 （先加2 mL 的SP600125 培養2 h 后，再加1 mL 補骨脂二氫黃酮甲醚，繼續培養48 h）。

1.3 MTT 檢測

細胞培養72 h 至結束前4 h，每孔加入20 μL 濃度為5 g/L 的MTT，繼續培養4 h 后，除去上清液，每孔加入150 μL DMSO，將96 孔板置于37℃恒溫震蕩培養器內震蕩10 min，使紫色結晶完全溶解。 酶標儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.4 黑素含量

將對數期A375 細胞以細胞濃度105個/孔接種于6 孔板，各組細胞均設5 個復孔，按分組給藥。酶標儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.5 TYR 活性

將對數期A375 細胞以細胞濃度5000 個/孔接種于96 孔板，每孔200 μL DMEM 完全培養液，各組細胞均設5 個復孔。酶標儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈式反應

1.6.1 總RNA 提取 細胞總RNA 的提取按照試劑盒說明操作。 引物設計：引物的設計與合成由上海生工生物工程技術服務有限公司提供， 以β-actin 為內參照，引物序列見表1。1.6.2 PCR 擴增 在冰水浴上的PCR 管中依次加入16.1 μL ddH2O、1.5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR Buffer、2.5 μL dNTP、1.3 μL MgCl2，最后加入0.1 μL Taq 酶，上游引物和下游引物各0.5 μL， 使PCR 管內終體積達到25 μL。將PCR 管放入PCR 擴增儀上，PCR 擴增程序見表2。

表1 引物序列

1.7 Western blot 實驗

蛋白樣品制備： 當細胞呈80%以上融合時，WIP組織細胞裂解液裂解提取總蛋白。 SDS-PAGE 電泳：按照BIO-RAD 公司說明書安裝SDS 聚丙烯酰胺凝膠玻璃板，分別灌制分離膠和濃縮膠。加樣：各40 μL 蛋白樣品。電泳：起始電壓為100 V，電泳10～20 min 后，藍色染料進入分離膠，則電壓升高到120 V，電泳至指示染料到距分離膠底部緣時1.0～0.5 cm 處時，停止電泳。 轉膜：濕轉，150 V 轉移130 min。 封閉：將轉膜后的PVDF 膜浸入盛有封閉液密閉小盒中，室溫封閉1 h。 一抗孵育稀釋比例均為1∶300，4℃過夜。 二抗孵育：二抗（二抗稀釋比例為1∶3500），室溫1 h。 顯影：ECL 顯影液顯影。

表2 擴增程序

1.8 統計學方法

實驗數據用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），用Tamhane 法進行方差齊檢驗，LSD 法和SNK 法對數據進行兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞活性的影響

與空白組比較，10-3μmol/L 的雌二醇組對細胞活性的作用無顯著性差異（P ＞0.05）；10、100 μmol/L 補骨脂二氫黃酮甲醚組對細胞的活性有顯著的抑制作用（P ＜0.01），1、10-1、10-2、10-3μmol/L 的補骨脂二氫黃酮甲醚組對A375 細胞活性均無顯著作用（P ＞0.05）。見表3。

表3 補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞活性的影響（±s，n = 6）

表3 補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞活性的影響（±s，n = 6）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；“-”表示無數據

組別 濃度（μmol/L） 吸光度空白組雌二醇組補骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-3 10-2 10-1 1 10 100 0.368±0.021 0.366±0.023 0.368±0.026 0.365±0.025 0.363±0.024 0.356±0.024 0.314±0.020**0.108±0.028**

2.2 ICI182780/SP600125 +補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞黑素合成的影響

與空白組比較，雌二醇組對黑素合成有顯著的促進作用，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；補骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組和SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組對黑素合成有顯著的抑制作用，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組和SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組對黑素合成有上調作用，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表4。

表4 ICI182780/SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞黑素合成的影響（±s，n = 5）

表4 ICI182780/SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞黑素合成的影響（±s，n = 5）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05；“-”表示無數據

組別 濃度（mol/L） 吸光度空白組雌二醇組補骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780 +補骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125 +補骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 10-6 0.079±0.004 0.108±0.014**0.039±0.002**0.051±0.001**#0.048±0.006**#

2.3 ICI182780/SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞TYR 活性的影響

與空白組比較，雌二醇組能顯著提高TYR 活性，差異有統計學意義（P ＜0.05）；補骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組對TYR 活性有顯著的抑制作用（P ＜0.01）。 與 補 骨 脂 二 氫 黃 酮 甲 醚 組 比 較，ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組均能顯著提高TYR 活性， 差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。 見表5。

表5 ICI182780/SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞TYR 活性的影響（±s，n = 5）

表5 ICI182780/SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞TYR 活性的影響（±s，n = 5）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無數據；TYR：酪氨酸酶

組別 濃度（mol/L） 吸光度空白組雌二醇組補骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 10-6 0.078±0.003 0.112±0.014*0.041±0.002**0.059±0.004**##0.056±0.004**##

2.4 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞mRNA 的影響

與空白組比較， 雌二醇組各指標mRNA 表達增強，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；補骨脂二氫黃酮甲醚組下調TYR、TRP-1/2、ERK1/2、JNK2 mRNA 表達，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。 與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組減弱了補骨脂二氫黃酮甲醚下調mRNA 表達的作用，且差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表6。

2.5 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞mRNA 表達的影響

與空白組比較，雌二醇組各指標mRNA 表達增強，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；補骨脂二氫黃酮甲醚組能明顯降低TYR、TRP-1/2、ERK1/2、JNK2 mRNA 的表達， 差異有高度統計學意義 （P ＜0.01）； 與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組下調TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA 表達的作用均被減弱，且差異有統計學意義（P ＜0.05）。 見表7。

表6 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞mRNA 的影響（±s，n = 4）

表6 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞mRNA 的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；“-”表示無數據

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β-actin ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β-actin空白組雌二醇組補骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.490±0.026 0.546±0.022**0.254±0.023**0.282±0.002##0.405±0.018 0.485±0.017**0.069±0.005**0.187±0.018##0.453±0.027 0.544±0.023**0.207±0.028**0.374±0.002##0.496±0.017 0.674±0.021**0.312±0.029**0.534±0.024##0.564±0.033 0.770±0.022**0.344±0.028**0.397±0.018#0.444±0.013 0.565±0.025**0.228±0.023**0.034±0.019##

表7 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞mRNA 表達的影響（±s，n = 4）

表7 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細胞mRNA 表達的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；“-”表示無數據

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β-actin ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β-actin空白組雌二醇組補骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.436±0.016 0.529±0.021**0.189±0.020**0.224±0.023#0.477±0.018 0.502±0.022*0.234±0.028**0.289±0.018#0.455±0.018 0.563±0.022**0.337±0.018**0.404±0.028#0.584±0.022 0.663±0.026**0.454±0.028**0.497±0.017#0.414±0.018 0.495±0.023**0.288±0.019**0.366±0.018##0.468±0.022 0.782±0.012**0.255±0.032**0.356±0.015##

2.6 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、 補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響

與空白組比較， 雌二醇組能顯著增強TYR、JNK蛋白的表達 （P ＜0.01）； 補骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組極顯著下調TYR、JNK 蛋白表達（P ＜0.01）。 與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組減弱了補骨脂二氫黃酮甲醚下調TYR、JNK 蛋白表達的作用（P ＜0.01）。 見表8、圖1。

2.7 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響

與空白組比較，雌二醇組TYR、JNK 蛋白表達增強（P ＜0.01）；補骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組極顯著下調TYR、JNK 蛋白表達（P ＜0.01）。 與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚組減弱補骨脂二氫黃酮甲醚下調TYR、JNK2 蛋白表達作用（P ＜0.01）。 見表9、圖2。

3 討論

在人皮膚黑素合成過程中不僅受TYR 及其相關蛋白調控，還受ER 信號通路以及細胞應激和損傷反應的主要信號通路ER-MAPKs 的調控[8-10]。 在黃褐斑患者的皮膚中發現，ER 的表達與色斑的嚴重程度有著密切的關系[11-13]。

表8 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響（±s，n = 4）

表8 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無數據；TYR：酪氨酸酶

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin JNK/β-actin空白組雌二醇組補骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.105±0.002 0.140±0.002**0.064±0.004**0.091±0.003**##0.099±0.002 0.129±0.011**0.061±0.019**0.075±0.002**##

圖1 ICI182780+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響

ER 是存在于靶器官細胞內的一種蛋白質分子，可與雌激素發生特異性結合而形成雌激素-受體復合物，使雌激素發揮其生物學效應。 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在炎癥信號轉導、細胞凋亡、腫瘤細胞增殖以及參與調控體內多種物質代謝過程中起重要作用。目前已確定在真核細胞中有4 條信號轉導通路：ERK 通 路、JNK 通 路、p38 通 路 和ERK5 通 路。ERK、JNK、P38MAPK 均由相鄰的蘇氨酸 （THR）和TYR 殘基雙磷酸化而激活，介導細胞生長、發育、分化及死亡全過程。激活細胞增殖及分化的信號調控因子ERK，可引起MITF 磷酸化降解，TYR 活性降低，導致黑素合成減少。JNK 通路可以通過降低cAMP 應答原件結合蛋白 （CREB） 的磷酸化水平， 抑制MITF 和TYR 的表達，實現抑制黑素生成的作用。p38MAPK 信號通路參與了黑素的合成過程，它通過上調酪氨酸酶基因的表達來發揮促進黑素合成的作用[14-16]。 骨脂素可增加T47D 細胞雌激素效應基因PR mRNA 的表達，且促增殖和誘導PR 表達增強的效應均可被雌激素受體拮抗劑ICI182780 所拮抗[17-20]。

表9 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響（±s，n = 4）

表9 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無數據

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圖2 SP600125+補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達的影響

本研究結果顯示，補骨脂二氫黃酮甲醚均能顯著抑制黑素合成和TYR 活性，而這種抑制作用可被經典ER 受體阻斷劑及JNK 受體阻斷劑所逆轉。 補骨脂二氫 黃 酮 甲 醚 能 顯 著 下 調TYR、TRP-1、TRP-2 及ERK1/2、JNK2 mRNA 的表達；TYR、JNK 的蛋白表達也明顯下降；基因表達和蛋白表達的下調同樣被經典ER 受體阻斷劑和JNK 受體阻斷劑所削弱。

綜上實驗結果可推測植物雌激素補骨脂二氫黃酮甲醚下調黑素合成的機制，可能是植物雌激素與雌激素膜受體結合啟動第二信使系統， 激活了ERMAPK 關鍵蛋白激酶ERK、JNK 信號通路而發揮了間接的轉錄調控作用，使TYR 活性、TYR 及相關蛋白酶表達降低來達到抑制黑素合成的作用。 因此，本實驗表明植物雌激素補骨脂二氫黃酮甲醚具有抑制黑素合成的作用，為黃褐斑的治療提供了一種新的藥物開發可能性， 而其治療黃褐斑的藥物機制可能是通過ER-MAPK 信號通路起作用，也為植物雌激素藥物的開發奠定了一定的基礎。

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