結核分枝桿菌蛋白抗原的研究進展

王潔玲 唐余燕 余永勝

上海交通大學附屬第六人民醫院感染科，上海 200233

結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是胞內寄生菌， 宿主主要依靠細胞免疫來清除感染，因此， 具有特異性免疫原性的MTB 蛋白抗原一直吸引著研究者的目光。隨著近年來基因重組與蛋白純化技術的不斷發展， 已經獲得多種結核桿菌蛋白，MTB蛋白具有抗原性，根據定位主要分為分泌蛋白、細胞壁蛋白和細胞漿蛋白。 現將MTB 的蛋白抗原應用研究進展綜述如下：

1 MTB 分泌蛋白

1.1 6 kD 早期分泌性抗原靶（6 kD early secretory antigenic target，ESAT6）

分泌蛋白ESAT6 是從MTB 短期培養濾液中純化分離出的蛋白質，分子量為9904 D。 ESAT6 在結核病的保護性細胞免疫反應中發揮重要作用，誘導特異性CD4+T 細胞和CD8+T 細胞（細胞毒性T 細胞，CTL）迅速增殖并釋放高水平的γ 干擾素（IFN-γ），有效地激活巨噬細胞，提高巨噬細胞對胞內結核桿菌的生長抑制作用和殺傷能力[1-2]。 Mir 等[3]試驗提示ESAT6 蛋白刺激結核桿菌感染小鼠的淋巴細胞增殖，誘導模型小鼠淋巴細胞產生大量的IFN-γ，進而降低小鼠的荷菌量，具有免疫治療潛力，進一步試驗顯示它還可以協同輔助傳統抗結核化療。 ESAT6 是在MTB 早期感染中起主要作用的抗原，同時擁有T 細胞及B 細胞抗原決定簇，可誘導C57BL/6 小鼠細胞免疫和體液免疫反應增強[4]。ESAT6 抗原僅存在于致病性分枝桿菌中，卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）及其他非致病性分枝桿菌中并不存在，這一特性有助于其成為診斷MTB 感染的特異性抗原。Feng 等[5]研究表明結核患者血清中抗ESAT6 抗體含量低， 單獨作為結核病血清學診斷試驗意義不大， 然而ESAT6 結核蛋白可作為結核病血清學診斷的組合抗原之一。 此外，ESAT6 蛋白與MTB 致病性相關， 卡介苗在傳代過程中丟失編碼ESAT6 的基因， 這很可能是卡介苗對肺結核免疫保護效果不理想的原因之一， 進一步研究ESAT6 對宿主免疫調節的機制將有助于疫苗的合理沒計和效果評價。Yuan 等[6]將編碼EAAT6 蛋白的DNA 疫苗用于小鼠結核病模型的治療取得了一定的效果，并能夠顯著降低小鼠結核病的復發率。

1.2 培養濾液蛋白10 （10 kD culture filtrate protein，CFP10）

MTB 培養濾液蛋白10 又稱為Mtb b11 或Mtb SA-10，是由Rv3874（1hp 基因）編碼的分子量為10 kD 的蛋白質。 CFP-10 與ESAT6 共同存在于MTB 短期培養濾液里，1hp 和esat6 基因都位于MTB 基因組RD1位點上，屬同一轉錄單位，有學者認為這兩種蛋白不僅協同表達，而且功能上也可能相輔相成。 CFP10 能夠刺激機體產生特異性抗體，可以用作特異的皮膚試驗抗原和血清學試驗的抗原。 Essone 等[7]、Luo 等[8]用ESAT6 和CFP10 復合抗原診斷MTB 感染獲得了較高的特異性和敏感性，尤其是能夠區分MTB 自然感染和BCG 接種以及非致病性分枝桿菌感染。Shaban 等[9]研究表明編碼CFP10 蛋白ESAT6 蛋白的多價DNA疫苗能產生顯著的潛在肺免疫應答，刺激特異性T 細胞反應可激發外周血單個核細胞增殖并產生IFN-γ，降低MTB 感染小鼠模型90%的細菌載量， 其中CD4 T 細胞反應和BCG 疫苗相似，CD8 T 細胞免疫優于BCG。 另外研究表明ESAT6 和CFP10 在MTB 和HIV合并感染者的診斷中也有較高的敏感性和特異性，相信它們在作為新型診斷制劑方面將會具有廣泛的應用前景[10]。

1.3 分泌蛋白MTB8.4

MTB8.4 蛋白是從結核桿菌H37Rv 株培養濾液中純化分離得到，由Rv1174c 基因編碼，其成熟蛋白（不含信號序列）分子量為8.4 kD。 低劑量MTB8.4 蛋白即可誘導機體強烈的免疫反應：一方面有效刺激機體的體液免疫，產生高水平的IgG1和IgG2；另一方面，誘導機體的CD4+Th1 型細胞免疫反應，分泌高水平的IFN-γ，并產生特異性CTL。 MTB8.4 可以成為結核病DNA 疫苗的候選抗原或亞單位疫苗的組分， 用于結核病的預防。 Xin 等[11]應用MTB8.4 構建亞單位疫苗免疫小鼠后，誘導特異性細胞免疫反應，以Th1 型反應為主，保護小鼠抵御毒性結核桿菌的攻擊，獲得與BCG 相似的免疫效果。 MTB8.4 適用于人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）合并MTB感染的診斷，可以作為未出現臨床癥狀但已感染結核病的診斷標志，讓患者能夠早期接受治療[12]。

1.4 分泌蛋白MPT63

MPT63 抗原是MTB 分泌的與MTB 毒力相關的小分子量蛋白，分子量為16 kD，編碼基因是Rv1926c。該抗原蛋白存在于MTB 復合群中，在環境MTB 中則不存在該抗原的基因。 Mustafa[13]研究表明，MPT63 蛋白是一種特異性抗原，誘導患者機體產生Th1 型細胞免疫應答，刺激T 淋巴細胞的免疫反應和誘導IFN-γ產生，具有較強的免疫原性。 MPT63 抗原還可以誘導體液免疫， 曾被應用于牛結核病血清學診斷的研究，大多數活動性結核患者對MPT63 抗原產生高水平的抗體，檢測血清抗體的敏感性和特異性分別為15.0%和98.7%，是血清學診斷試劑的必然方向[14]。

1.5 MPT64

MPT64 又名MPB64， 是最早發現的結核桿菌特異性抗原， 分子量為26 kD， 由mpt64 基因編碼，占MTB 的分泌蛋白總量的8%。 研究表明，MPT64 蛋白基因在普通弱毒株BCG 中有變化， 作為疫苗的BCG中不含該抗原基因，MPT64 蛋白的這種缺失性， 能很好地使其作為血清診斷和新疫苗的候選抗原。研究發現MPT64 蛋白的T 淋巴細胞抗原表位主要在124～143 位氨基酸殘基區域，MPT64 抗原具有較好的穩定性、特異性和敏感性，是用作血清學診斷試劑抗原的必然方向[15]。 該抗原可由大多數MTB 感染者機體免疫識別， 此外小鼠等動物實驗結果都顯示其主要誘導機體特異性CTL 的形成和IFN-γ 的分泌，可抵御MTB 的感染[16]。

1.6 MPT32

有學者從MTB 培養液中分離出MPT32， 并因它的高LI 值而定義為分泌蛋白， 進一步試驗克隆相關基因， 其推導出來的氨基酸序列為：DPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPA， 因為該段序列中脯氨酸和丙氨酸所占比例較高，分別為21.7%和19.0%，故該蛋白序列的編碼基因命名為apa。 MPT32 抗原與麻風分枝桿菌的纖維連接蛋白具有同源性[17]。抗原MPT32 在結核病進展早期（早于廣泛空洞形成或體內胞外復制）由MTB 分泌，根據這一特性，MPT32 抗原具有早期結核病的血清早期診斷價值。 Wu 等[18]研究MTB17 種抗原在結核病血清學診斷中的應用價值， 發現MPT32能刺激機體產生特異性抗體， 并可與其他MTB 抗原形成互補，提高結核病患者尤其是菌陰肺結核及肺外結核病的陽性檢出率。

1.7 抗原85（Ag85）復合物

Ag85 復合物是一組具有較強免疫活性的抗原，包括Ag85A、Ag85B 和Ag85C 三個組分，可占結核菌分泌蛋白總量的30%～40%。 Ag85 復合物能和人的纖維結合蛋白（fibronectin，FN）結合，大量存在于活動性結核病患者血清中，而非活動性結核病或其他肺部疾病患者等血清中則不存在。 Ag85 復合物黏附于細胞表面，與MTB 的致病性密切相關[19]。Ag85 復合物有分枝菌酸轉移酶活性， 使海藻糖轉移和沉積于細胞壁，在細胞壁合成的晚期發揮重要作用[20]。 分枝桿菌各菌株均可分泌Ag85，Ag85 分子具有特異性T 細胞識別位點，Beamer 等[21]報道用MTB Ag85 復合物編碼基因的質粒DNA 免疫小鼠， 誘導小鼠產生很強的細胞免疫和體液免疫反應， 能顯著促進T 細胞增殖， 活化CD8+T 細胞，并產生大量白細胞介素（IL）-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等因子，能夠清除MTB 的感染。Husain 等[22]用Ag85 蛋白免疫BALB/c 小鼠的試驗研究表明Ag85 抗原可誘導特異性的細胞核體液免疫反應，可刺激機體產生Th1 型細胞因子，并證明可以誘導增強BCG 疫苗的免疫保護效力。

2 MTB 胞壁蛋白

MTB 細胞壁主要是結核菌蛋白、分枝桿菌酸、半乳聚糖及甘露聚糖。 由于胞壁蛋白存在于細胞的表面， 脂蛋白類抗原是引起免疫反應的一類主要抗原，如38、27、19、16 kD 等。 脂蛋白38 kD 抗原存在于多種分枝桿菌中，參與磷酸鹽代謝，脂質部分錨定在質膜上，具有磷酸鹽轉運活性。 MTB 膜蛋白16 kD 具有結核桿菌特異的抗原表位，為小分子熱休克蛋白家族成員之一。 Koz'lowska 等[23]發現38 kD 蛋白診斷活動性結核、16 kD 蛋白抗原診斷非活動性結核的效果非常好，從而提出聯合應用蛋白抗原是血清學診斷發展的方向。

3 MTB 胞漿蛋白

胞漿蛋白大體有酶蛋白和應激蛋白等， 承擔MTB 自身代謝及抵抗免疫系統攻擊的作用。 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）由4 種相對分子量約為23 kD 的亞單位組成， 與MTB 消除活性氧基團有關，并消除宿主產生的活性氧基團以逃避機體殺傷作用[24]。 應激蛋白又稱為熱休克蛋白（heat shock protein，HSP），參與蛋白質轉位、折疊和裝配等重要胞生理活動，被稱為“分子伴侶”。 熱休克蛋白通過蛋白與蛋白之間的相互作用發揮許多調節功能，對細胞有保護作用。 作為抗原HSP 不適用于人類疫苗的研究，因為熱休克蛋白高度保守，在不同的菌屬，甚至真菌細胞的同類蛋白也有很高的同源性[25]。

綜上所述，隨著近年來基因重組與蛋白純化技術的不斷發展，已經獲得多種結核桿菌蛋白，MTB 蛋白具有抗原性，可以誘導機體產生特異性的細胞免疫和體液免疫，這些蛋白對開發結核病的診斷、皮試反應、發病機制研究以及開發新疫苗均具有重要意義。

[1] Matvieieva N，Shakhovsky A，Kvasko O，et al. High frequency genetic transformation of cichorium intybus L. using nptⅡgene as a selective marker [J]. TSitol Genet，2015，49（4）：11-16.

[2] Biraro IA，Egesa M，Kimuda S，et al. Effect of isoniazid preventive therapy on immune responses to mycobacterium tuberculosis：an open label randomised，controlled，exploratory study [J]. BMC Infect Dis，2015，15（1）：438.

[3] Mir SA，Verma I，Sharma S. Immunotherapeutic potential of recombinant ESAT-6 protein in mouse model of experimental tuberculosis [J]. Immunology letters，2014，158（1-2）：88-94.

[4] Lu Y，Xu Y，Yang E，et al. Novel recombinant BCG coexpressing Ag85B，ESAT-6 and Rv2608 elicits significantly enhanced cellular immune and antibody responses in C57BL/6 mice [J]. Scand J Immunol，2012，76 （3）：271-277.

[5] Feng X，Xiu B，Chen K，et al. Enhanced serodiagnostic utility of novel Mycobacterium tuberculosis polyproteins [J].J Infect，2013，66（4）：366-375.

[6] Yuan W，Dong N，Zhang L，et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine expressing a fusion protein of Ag85B-Esat6-HspX in mice [J]. Vaccine，2012，30（14）：2490-2497.

[7] Essone PN，Chegou NN，Loxton AG，et al. Host cytokine responses induced after overnight stimulation with novel M. tuberculosis infection phase-dependent antigens show promise as diagnostic candidates for TB disease [J]. PLoS One，2014，9（7）：e102584.

[8] Luo W，Qu ZL，Xie Y，et al. Identification of a novel immunodominant antigen Rv2645 from RD13 with potential as a cell-mediated immunity-based TB diagnostic agent[J].J Infection，2015. [Epub ahead of print].

[9] Shaban K，Amoudy HA，Mustafa AS. Cellular immune responses to recombinant Mycobacterium bovis BCG constructs expressing major antigens of region of difference 1 of Mycobacterium tuberculosis[J].Clin Vaccine Immunol，2013，20（8）：1230-1237.

[10] Fang Z，Van Der Merwe RG，Waren RM，et al. Assessing the progress of Mycobacterium tuberculosis H37Rv structural genomics [J]. Tuberculosis （Edinb），2015，95（2）：131-136.

[11] Xin Q，Niu H，Li Z，et al. Subunit vaccine consisting of multi-stage antigens has high protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis infection in mice [J]. PLoS One，2013，8（8）：e72745.

[12] Ablanedo-Terrazas Y，Alarado-de la Barrera C，Hernandez-Juan R，et al. Xpert MTB/RIF for diagnosis of tuberculous cervical lymphadenitis in HIV-infected patients[J].Laryngoscope，2014，124（6）：1382-1385.

[13] Mustafa AS. Comparative evaluation of MPT83（Rv2873）for T helper-1 cell reactivity and identification of HLApromiscuous peptides in Mycobacterium bovis BCG -vaccinated healthy subjects [J]. Clin Vaccine Immunol，2011，18（10）：1752-1759.

[14] Phong TQ，Ha do TT，Volker U，et al. Using a label free quantitative proteomics approach to identify changes in protein abundance in multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis [J]. Indian J Microbiol，2015，55 （2）：219-230.

[15] Kumar N，Agarwal A，Dhole TN，et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical isolates by combining presumptive cord formation and MPT64 Antigen Immunochromatographic Assay [J]. Indian J Tuberc，2015，62（2）：86-90.

[16] Arora J，Kumar G，Verma AK，et al. Utility of MPT64 antigen detection for rapid confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex [J]. J Glob Infect Dis，2015，7（2）：66-69.

[17] Mustafa T，Leversen NA，Sviland L，et al. Differential in vivo expression of mycobacterial antigens in Mycobacterium tuberculosis infected lungs and lymph node tissues[J].BMC Infect Dis，2014，14：535.

[18] Wu X，Yang Y，Zhang J，et al. Comparison of antibody responses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis [J]. Clin Chim Acta，2010，411（19-20）：1520-1528.

[19] Schmidt-Schultz TH，Schultz M. AG 85，a major secretion protein of Mycobacterium tuberculosis，can be identified in ancient bone [J]. Tuberculosis（Edin），2015，95（Suppl 1）：S87-S92.

[20] Favrot L，Lajiness DH，Ronging DR. Inactivation of the Mycobacterium tuberculosis antigen 85 complex by covalent，allosteric inhibitors [J]. J Biol Chem，2014，289（36）：25031-25040.

[21] Beamer GL，Cyktor J，Flaherty DK，et al.CBA/J mice generate protective immunity to soluble Ag85 but fail to respond efficiently to Ag85 during natural Mycobacterium tuberculosis infection [J]. Eur J Immunol，2012，42（4）：870-879.

[22] Husain AA，Warke SR. Comparative evaluation of booster efficacies of BCG，Ag85B，and Ag85B peptides based vaccines to boost BCG induced immunity in BALB/c mice：a pilot study [J]. Clin Exp Vaccine Res，2015，4（1）：83-87.

[23] Kozlowska I，Filewska M，Rozy A，et al. Evaluation of humoral immune response against mycobacterial antigens in bronchoalveolar lavage fluid from patients with pulmonary tuberculosis confirmed by genetic and culture methods [J]. Pneumonol Alergol Pol，2007，75（4）：355-362.

[24] Forbes LV，Furtmuller PG，Khalilova I，et al. Isoniazid as a substrate and inhibitor of myeloperoxidase：identification of amine adducts and the influence of superoxide dismutase on their formation [J]. Biochem Pharmacol，2012，84（7）：949-960.

[25] Tsukamoto Y，Maeda Y，Tamura T，et al. Polyclonal activation of naive T cells by urease deficient-recombinant BCG that produced protein complex composed of heat shock protein 70，CysO and major membrane protein-Ⅱ[J].BMC Infect Dis，2014，14：179.