真性紅細胞增多癥患者骨髓間充質干細胞體外造血支持功能研究

孫 儀 段永娟 李 芳，2 呂軍強 白 潔 劉漢芝 胡 曉

1.中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院 血液學研究所實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020；2.山東大學附屬濟南市中心醫院醫學實驗診斷中心，山東濟南 250013

真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）是一種起源于克隆性造血干細胞的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）[1]， 其臨床表現除紅系增多外，通常也伴隨粒系和血小板異常升高。 臨床上將PV 分為增殖期（多血期）和消耗期（多血后期）。疾病進展至消耗期的患者紅細胞生成逐漸減少，骨髓發生無效造血導致貧血，常伴隨骨髓纖維化。 少部分患者進一步轉化為預后不良的骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）或白血病[2]。

骨髓間充質干細胞 （bone marrow stem cell，BMSC）是骨髓造血微環境的重要組成部分， 參與多種血液系統疾病的發生和發展。 近年來研究發現，在MDS及多種白血病中均存在BMSC 功能或細胞遺傳學的改變，這種改變對造血干細胞功能異常重要[3-4]。 對MPN 患者骨髓微環境的研究尚在起步階段[5-6]。 本研究分離初診PV 患者的BMSC 并對其造血支持功能進行分析，為進一步研究骨髓微環境在PV 疾病進展過程中的作用提供一定依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011 年5 月～2012 年7 月在中國醫學科學院血液病醫院（以下簡稱“我院”）就診的9 例初診PV 患者，診斷標準參照WHO 規定的PV 診斷標準[7]，其中男4 例，女5 例；年齡29～83 歲，中位年齡61 歲；其中7 例JAK2 V617F 突變陽性，2 例突變陰性；3 例與患者無血緣關系的健康志愿者。在患者及健康志愿者知情同意下獲得其樣本，實驗方案獲得我院倫理委員會審核通過。

1.2 BMSC 分離培養

各取PV 患者和健康志愿者骨髓5 mL， 肝素抗凝，用Ficoll 法分離單個核細胞，在含有2 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子 （bFGF）、10 ng/mL 表皮生長因子（EGF）（均購自Peprotech 公司）、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM-F12 培養基（均購自GIBCO 公司）中培養，培養48 h 后換液除去未貼壁細胞，此后每隔3 d 換液1 次。 當細胞達到90%融合時，按1∶2 傳代。 取第3 代至第6 代細胞用于后續實驗。

1.3 細胞免疫表型鑒定

制備PV-BMSC 的單細胞懸液， 分別加入1 μL下 述 鼠 抗 人 熒 光 抗 體CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD49e、CD73、CD90、CD105 （均為PE 標記）、CD14（APC 標記）和相應熒光素標記的鼠同型對照抗體（均為eBioscience 公司產品），避光孵育30 min 后，離心洗滌未結合抗體，流式細胞儀檢測。 使用Diva 軟件（購自BD Biosciences 公司）進行數據分析。

1.4 BMSC 的誘導分化

真性紅細胞增多癥患者來源的骨髓間充質干細胞 （PV-BMSC） 和正常人來源的骨髓間充質干細胞（NM-BMSC）按1×104/cm2分別接種于6 孔板內，融合度達80%時，將培養基更換為成脂或成骨分化誘導培養基。成骨和成脂分化誘導培養基配方及實驗方法參考文獻[8]。

1.5 BMSC 的體外造血支持功能檢測

PV-BMSC 和NM-BMSC 按4×104/孔 接 種 于24孔板；在含2 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM-F12 培養基中培養24 h 后，按1×104/孔加入臍帶血來源的CD34+造血干祖細胞（HSPC）（CD34 陽性率大于90%），用無血清造血干細胞培養基StemspanTMSFEM（購自Stemcell Techologies 公司）培養7 d 后，收集懸浮細胞，細胞計數、 檢測CD34+細胞比例并計算共培養后總細胞及CD34+HSPC 的擴增倍數。

2 結果

2.1 PV-BMSC 的細胞形態

從PV 患者和健康志愿者骨髓中分離的單個核細胞培養24 h 后可見貼壁細胞。 培養3～4 d 后集落增大，2～3 周后細胞融合度達到80%～90%。 光鏡下觀察，貼壁細胞呈梭形或多角形；傳至第3 代后，細胞形態較為均一，成渦旋狀排列。PV-BMSC 和NM-BMSC的生長速度和細胞形態無明顯差異。 見圖1。

圖1 PV-BMSC 和NM-BMSC 的形態比較

2.2 PV-BMSC 的細胞表面標記

采用流式細胞術分析細胞表面標記。 9 株PV-BMSC 細胞均高表達CD73、CD90、CD105 和CD44 等間充質干細胞相關分子 （＞90%）， 不表達CD14、CD31、CD34 和CD45 等造血和內皮細胞相關的分子（＜0.1%）。

表1 PV-BMSC 體外造血支持功能

2.3 PV-BMSC 的成骨和成脂分化潛能

對本研究中分離的9 株PV-BMSC 分別進行成骨和成脂分化誘導實驗，以NM-BMSC 作為對照。 經油紅O 和Von Kossa 染色法證明PV-BMSC 具有與NM-BMSC 相似的多向分化潛能（圖2，封三）。

圖2 PV-BMSC 和NM-BMSC 的成脂及成骨分化（見內文第11 頁）

2.4 PV-BMSC 的體外造血支持功能

在無血清和外源造血細胞因子支持的條件下，將上述分離的9 株PV-BMSC 分別與人臍帶血來源的CD34+HSPC 用StemspanTMSFEM 共培養7 d，細胞計數，分析CD34+HSPC 細胞比例并計算總細胞及CD34+HSPC 細胞擴增倍數，結果見表1。 按照細胞擴增結果， 將9 株PV-BMSC 分為三組： 第一組5 株PV-BMSC 細胞（55%）總細胞和CD34+HSPC 擴增均大于1.5 倍， 第二組PV-BMSC 細胞PV-1 和PV-9（22%）CD34+HSPC 擴增小于1.5 倍， 第三組PVBMSC 細胞PV-3 和PV-9 （22%） 總細胞和CD34+HSPC 均未增加（小于1 倍）。

3 討論

PV 是攜帶JAK2 等基因突變的惡性造血干細胞的克隆性增殖引起的一類惡性血液病[9]，但靶向JAK2的抑制劑及其他骨髓抑制類藥物未能完全治愈該類疾病[10-11]。 造血微環境對造血干細胞的增殖和分化有重要的調節作用，BMSC 是造血微環境的重要組成細胞， 因此研究MPN 患者的骨髓微環境可能為疾病治療提供新方案。 本研究以初診PV 患者骨髓中分離的BMSC 作為研究對象，分析了患者BMSC 的造血支持功能，以期為PV 病程的進展和轉歸提供更多的臨床預后標志。

本研究分離培養了9 株PV-BMSC， 分離所得細胞在生長速度、細胞形態、免疫表型及成骨和成脂分化能力等方面均與NM-BMSC 沒有明顯差異。選取的PV 患者中7 例攜帶JAK2 V617 基因突變，其余2 例不攜帶該突變， 但RT-PCR 方法檢測后未發現PVBMSC 中存在JAK2 V617 基因突變（未發表數據），與田竑等[12]和段麗敏[13]早前的研究結果一致，提示JAK2基因突變僅存在于造血干祖細胞。

MSC 可以通過分泌細胞因子和細胞間直接接觸發揮造血支持功能[14-15]。 2014 年，Schneider 等[5]發現PV-BMSC 培養上清對人HSPC 的體外造血集落（CFU）支持能力低于正常對照，提示PV-BMSC 的造血支持功能發生改變。 本研究發現， 初診PV 患者BMSC 的造血支持功能呈現出明顯的個體差異性。 只有半數左右患者（約占55%）的BMSC 仍具有支持HSPC 增殖的功能，大約有22%的患者（PV-3 和PV-9）的BMSC 發生HSPC 擴增支持功能的顯著缺失。 利用造血集落形成實驗也驗證了造血支持功能低下的PV-BMSC 對造血集落及各系分化的影響與對細胞擴增的結果一致 （未發表數據）。 通過對比病例資料發現，PV-BMSC 造血支持功能改變與患者的年齡、性別及JAK2 基因突變均無明確相關性。

Schneider 等[5]的工作僅比較了5 例JAK2 突變陽性的男性患者的BMSC 上清與正常BMSC 上清造血支持功能。 本研究則對比了4 例男性及5 例女性（其中7 例JAK2 V617 突變陽性和2 例陰性）PV 患者的BMSC 細胞共培養后的造血支持功能。

骨髓纖維化、MDS 或急性髓系白血病等幾類疾病的患者中均可檢測到BMSC 失去部分造血支持功能[16-17]。 初診PV 患者的BMSC 的造血支持功能改變是否與PV 疾病進展有關尚未見相關報道。 本研究發現PV-BMSC 的造血支持功能具有顯著的個體差異性將為回答這一問題提供一定的實驗依據。 由于PV進展的病程較長[18]以及BMSC 存在異質性，下一步筆者將在條件許可的情況下擴大研究的患者數，進行列隊分析和長期追蹤。

MSC 可通過多種機制發揮造血支持功能。已有報道顯示，PV 患者的血清中，多種細胞因子水平（如白細胞介素-6、白細胞介素-11、白血病抑制因子、巨噬細胞集落刺激因子和干細胞因子等）異常[19-20]。在本研究結果的基礎上，筆者將通過細胞因子芯片、二代測序等技術，進一步發掘新的調控造血支持功能的細胞因子和基因，以期揭示影響個體PV 患者BMSC 造血支持功能的分子機制。

[1] Jaffe ES，Harris NL，Stein H，et al. Pathology & genetics of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues [M].IARC，WHO，2001.

[2] 張之南.血液病學[M].北京：人民衛生出版社，2011：936-938.

[3] Zhao ZG，Xu W，Yu HP，et al. Functional characteristics of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of patients with myelodysplastic syndromes [J]. Cancer Letters，2012，317（2）：136-143.

[4] Pavlaki K，Pontikoglou CG，Demetriadou A，et al. Impaired proliferative potential of bone marrow mesenchymal stromal cells in patients with myelodysplastic syndromes is associated with abnormal wnt signaling pathway [J]. Stem Cells Dev，2014，23（14）：1568-1581.

[5] Schneider RK，Ziegler S，Leisten I，et al. Activated fibronectin -secretory phenotype of mesenchymal stromal cells in pre-fibrotic myeloproliferative neoplasma [J]. J Hematol Oncol，2014，7（1）：1-4.

[6] Arranz L，Sanchez-Aguilera A，Martin-Perez D，et al. Neuropathy of haematopoietic stem cell niche is essential for myeloproliferative neoplasma[J].Nature，2014，512（7512）：78-81.

[7] Ayalew T，Juergen T，Attilio O，et al. Proposals and rationale for revision of the World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera，essential thrombocythemia，and primary myelofibrosis：recommendation from an ad hoc international expert panel [J]. Blood，2007，4（110）：1092-1097.

[8] Zheng C，Yang S，Guo Z，et al. Human multipotent mesenchymal stem cells from fetal lung expressing pluripotent markers and differentiating into cell types of three germ layers [J]. Cell Transplant，2009，18（8）：1093-1109.

[9] James C，Ugo V，Couedic JP，et al. A unique clonal Jak2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera [J]. Nature，2005，434（7037）：1144-1148.

[10] Kiladigian JJ，Winton EF，Talpaz M，et al. Ruxolitinib for the treatment of patients with polycythemia vera [J]. Exper Rev Hematol，2015，8（4）：391-401.

[11] Debeume F，Lacout C，Moratal C，et al. JAK2 inhibition has different therapeutic effects according to myloproliferative neoplasm development in mice [J]. J Cell Mol Med，2015，19（11）：2564-2574.

[12] 田竑，陳廣華，徐楊，等.骨髓增殖性腫瘤患者骨髓間充質干細胞生物學特性極其JAK2 突變的研究[J].中華血液學，2012，33（9）：701-704.

[13] 段麗敏.真性紅細胞增多癥的細胞遺傳學極其骨髓間充質干細胞功能特性的研究[D].南京：南京醫科大學，2007.

[14] Khoury M，Drake A，Chen Q，et al. Mesenchymal stem cells secreting angiopoietin-like-5 support efficient expansion of human hematopoietic stem cells without compromising their repopulating potential [J]. Stem Cells Dev，2011，20（8）：1371-1381.

[15] Gottschling S，Saffrich R，Seckinger A，et al. Human mesenchymal stromal cells regulate initial self-renewing divisions of hematopoietic progenitor cells by a β1-integrin-dependent mechanism [J]. Stem Cells，2007，25（5）：798-806.

[16] Johnson RC，Kurzer JH，Greenberg PL，et al. Mesenchymal stromal cell density is increased in higher grade myelodysplastic syndromes and independently predicts survival [J]. Am J Clin Pathol，2014，142（6）：796-802.

[17] Kim JA，Shim JS，Lee GY，et al. Microenvironmental remodeling as a parameter and prognostic factor of heterogenous leukemogenesis in acute myelogenous leukemia [J]. Cancer Res，2015，75（11）：2222-2231.

[18] Passamonti F，Malabarba L，Orlandi E，et al. Polycythemia vera in young patients：a study on the long-term risk of thrombosis，myelofibrosis and leukemia [J]. Haematologica，2003，88（1）：13-18.

[19] Pourcelot E，Trocme C，Mondet J，et al. Cytokine profiles in polycythemia vera and essential thrombocythemia patients：clinical implications [J]. Exp Hematol，2014，42（5）：360-368.

[20] Boissinot M，Cleyrat C，Vilaine M，et al. Anti-inflammatory cytokines hepatocyte growth factor and interleukin-11 are over-expressed in Polycythemia vera and contribute to the growth of clonal erythroblasts independently of JAK2V617F [J]. Oncogene，2011，30（8）：990-1001.