高效液相色譜法測(cè)定艾附暖宮丸中芍藥苷和阿魏酸的含量

李洪亮 喬 靜，2▲

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北十堰 442000

艾附暖宮丸是市售非處方婦科用藥，該藥被《中國(guó)藥典》2015 年版一部收載， 處方被 《仁齋直指附遺》、《回春》、《女科切要》、《古今醫(yī)鑒》 等多部古醫(yī)書(shū)記載，由艾葉（炭）、醋香附、制吳茱萸、肉桂、當(dāng)歸、川芎、白芍（酒炒）、地黃、炙黃芪和續(xù)斷等組成。 具有理氣補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、溫暖子宮的功效。 用于血虛氣滯、下焦虛寒所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等癥[1]，是治療因寒凝而致的月經(jīng)不調(diào)、小腹疼痛、經(jīng)血量少、久無(wú)子息等病癥的代表方劑[2]。芍藥苷、阿魏酸是白芍、當(dāng)歸、川芎的主要有效成分。 目前市售艾附暖宮丸的規(guī)格較多，相關(guān)質(zhì)量控制研究文獻(xiàn)報(bào)道較少[2-5]，丁華[6]調(diào)查了市售36 批艾附暖宮丸，結(jié)果顯示合格率只有97%，并得出結(jié)論，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還需進(jìn)一步完善和提高。 艾附暖宮丸處方組成復(fù)雜，《中國(guó)藥典》2015 年版一部該藥項(xiàng)下規(guī)定檢測(cè)本品芍藥苷的含量，專(zhuān)屬性較差，難以評(píng)價(jià)全面質(zhì)量。目前，高效液相色譜已經(jīng)普及，同時(shí)測(cè)定兩種或以上成分的方法已廣泛應(yīng)用于中藥飲片、提取物及制劑質(zhì)量控制[7-9]。處方中當(dāng)歸、川芎、白芍均為君藥，基于此，本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定本品中芍藥苷、阿魏酸含量，能夠更好地控制制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-20A 高效液相色譜儀 （LC-20AD泵，SPD-M20A 檢測(cè)器，SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，吉爾森TC-100 柱溫箱，LCsolution 色譜工作站）；FA-2004 電子分析天平（上海天平儀器廠）；KQ3200 超聲波清洗儀（江蘇昆山超聲波儀器廠）；艾附暖宮丸（天津天士力公司，9 g×14 袋/盒，批號(hào)：20140318；北京同仁堂股份有限公司同仁堂制 藥廠，6 g×10 袋/盒， 批 號(hào)：1035034；山西華康藥業(yè)股份有限公司，9 g×10 丸/盒，批號(hào)：20110501；內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司，4 g×6 袋/盒，批號(hào)：20130632）；芍藥苷對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院 （批號(hào)分別為：120903-200809，0773-9910）；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥恒重的芍藥苷、阿魏酸對(duì)照品適量，加50%乙醇稀釋成每毫升溶液中芍藥苷430 μg、阿魏酸489.6 μg 的儲(chǔ)備液備用。2.1.2 供試品溶液的制備 取艾附暖宮丸， 小丸碾碎，取2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 50%乙醇，精密稱(chēng)定重量，超聲處理40 min，放冷，補(bǔ)足重量， 轉(zhuǎn)移至20 mL 玻璃離心管中，3000 r/min 離心5 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按處方工藝制備不含白芍、當(dāng)歸和川芎的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下條件制備，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Sinochrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30℃，流動(dòng)相：乙腈：0.03 mol/L 醋酸銨（含0.25%甲酸）（13∶87），流速：0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230～321 nm，進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下芍藥苷、阿魏酸同雜質(zhì)峰的分離度大于1.5， 且陰性樣品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間無(wú)干擾。 結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 測(cè)定方法

精密吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以回歸方程計(jì)算樣品中芍藥苷、阿魏酸的含量。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A）、樣品溶液（B）、陰性樣品溶液（C）的HPLC 色譜圖

取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇溶液稀釋成5.2、10.4、20.8、31.2、41.6 μg/mL 的溶液，10 μL 注入色譜儀，以濃度為縱坐標(biāo)（Y），峰面積為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=2.388 173×10-5X-8.639 89，r=0.998 32，表明芍藥苷在5.2～41.6 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 另取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇溶液稀釋成0.489、0.979、1.958、2.937、3.916 μg/mL 的溶液，10 μL 注入色譜儀，以濃度為縱坐標(biāo)（Y），峰面積為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=2.79 451×10-7X-6.070 66×10-2（r=0.999 716）；表明阿魏酸在0.489～3.916 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取芍藥苷、阿魏酸對(duì)照品溶液各10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定芍藥苷、阿魏酸峰面積積分值，結(jié)果芍藥苷的RSD 為1.32%， 阿魏酸峰面積的RSD 為0.38%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的樣品溶液（山西華康藥業(yè)股份有限公司，9 g×10 丸/盒，批號(hào)：20110501）5 份，進(jìn)樣10 μL，以回歸方程計(jì)芍藥苷、阿魏酸的含量，平均含量分別為22.37、2.38 μg/mL，RSD 分別為1.23%和0.98%，表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品的供試品溶液分別在1、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，6 次測(cè)定芍藥苷、阿魏酸面積的RSD 分別為0.85%、1.23%，表明該溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批號(hào)（天津天士力，9 g×14 袋/盒，批號(hào)：20140318）的艾附暖宮丸0.2 g，分別加入芍藥苷、阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量， 使溶液中加入芍藥苷的含量為5、10、20 μg/mL；阿魏酸的含量為1.0、1.5、2.0 μg/mL。 按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 芍藥苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）

表2 阿魏酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

對(duì)4 批艾附暖宮丸進(jìn)行含量測(cè)定以回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定（n = 3）

3 討論

《中國(guó)藥典》2010 年版記載艾附暖宮丸功效為理氣養(yǎng)血，暖宮調(diào)經(jīng)。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·舉痛論》指出“通則不痛，痛則不通”，其是用于氣滯、寒凝、濕熱淤阻所致子宮血?dú)膺\(yùn)行不暢[10]。 艾附暖宮丸以理氣補(bǔ)血、溫經(jīng)散寒、暖宮活血為主[11]，組方中黃芪、當(dāng)歸、生地黃、白芍、川芎具有益氣養(yǎng)血、補(bǔ)虛止痛作用[12]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，當(dāng)歸、 川芎均含有的阿魏酸、揮發(fā)油等成分具有改善微循環(huán)、松弛平滑肌、抗菌消炎等作用[13-14]。白芍主要有效成分是白芍總苷，具有調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)等多種藥理作用[15]。 處方中當(dāng)歸、川芎、白芍均為君藥，故其有效成分可作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要考察指標(biāo)。

由于樣品來(lái)自不同廠家， 受到中藥材原料產(chǎn)地、采收季節(jié)、加工等因素影響[16-19]，造成樣品被測(cè)成分含量出現(xiàn)大差異。川芎、當(dāng)歸中均含有阿魏酸，因此在本法中測(cè)定的阿魏酸含量為川芎、 當(dāng)歸兩者的總含量。芍藥苷、阿魏酸的含量結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[3]。

《中國(guó)藥典》2015 年版規(guī)定艾附暖宮丸小蜜丸中白芍苷含量不得于0.45 mg/g， 由表3 可見(jiàn)檢測(cè)樣品中芍藥苷平均含量均符合規(guī)定，阿魏酸含量與文獻(xiàn)報(bào)道一致，平均含量在0.60～0.90 mg/g，暫可定其含量為最低不得少于0.60 mg/g。

參閱文獻(xiàn)[1-3]，測(cè)試體積分?jǐn)?shù)分別為25%、50%、75%、100%甲醇溶液，超聲40 min，以50%甲醇提取的阿魏酸、芍藥苷含量較高，因此采用50%甲醇超聲30 min。 由于通過(guò)DAD 檢測(cè)器掃描顯示芍藥苷最大吸收在230 nm、阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)為321 nm，兩者吸收波長(zhǎng)存在較大差異， 因此采用了DAD 全波長(zhǎng)掃描，將波長(zhǎng)定位230～321 nm 區(qū)間，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可考慮作為艾附暖宮丸檢測(cè)方法。

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