AQP4與PKC在大鼠CIR后腦水腫模型中的變化及作用

劉新亞等

[摘要]目的通過研究大鼠局灶性腦缺血再灌注后水通道蛋白4（AQP4）、蛋白激酶C（PKC）表達水平的變化，來探討兩者與腦水腫之間的關系。方法通過線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血（MCAO）再灌注模型，動物隨機分為正常對照組（Norm）、假手術組（Sham）、缺血再灌注組（CIR）。參照Garcia JH法進行神經功能缺損評分、用Elliot法檢測腦組織含水量、免疫組化法檢測AQP4及PKC的表達。結果CIR后6h即有神經功能缺損，腦含水量在CIR12h明顯升高，1～3d時達到高峰；AQP4表達在早期水平降低，從12h逐漸升高，至CIR 24h明顯升高，3d達高峰；PKC在CIR后6h開始持續性升高，至第5d仍保持較高水平。結論早期的細胞源性腦水腫可能和PKC的升高有關，后期的血管源性腦水腫可能和AQP4的升高相關。

[關鍵詞]水通道蛋白4；蛋白激酶C；腦水腫

中圖分類號：R743.3文獻標識碼：A文章編號：1009_816X（2014）06_0456_03

[Abstract] Objective By studying the changes of expression levels of aquaporin4 （AQP4） and protein kinase C （PKC） after focal cerebral ischemia_reperfusion in rats to investigate the relation among AQP4， PKC and brain edema. Methods The model of middle cerebral artery （MCA） of rats was duplicated by using the suture method. The rats were randomly divided into normal control group （Norm）， sham_operation group （Sham）， cerebral ischemia reperfusion group （CIR）. Scores of neurofunctional defect were graded according to Garcia JH method， Elliot method was used to measure water content in brain tissue， the expression of AQP4 and PKC in brain tissue was observed by immunohistochemistry. Results After cerebral ischemia_reperfusion （CIR）， Neurofunctional defect occurred after 6h. Water content in brain tissue increased after CIR 12h， which was up to highest point after 1_3days. The expression levels of AQP4 decreased in early， then the levels increased gradually since 12h later， obviously increased CIR24 h， and to highest point after 3 days. While PKC increased gradually after CIR6h， and kept high level for 5 days. Conclusions Early Cell_derived brain edema may relate to the rise of PKC； upper vasogenic brain edema may be related to the rise of AQP4.

[Key words] Aquaporin4 （AQP4）； Protein Kinase C （PKC）； Brain edema

水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）與腦水腫關系密切[1]，AQP4是分布在腦組織中主要與水通透有關的水通道蛋白，具有選擇性的水轉運功能。目前對AQP4在水分子轉運及水平衡調節過程中具體作用機制越來越被眾多學者關注：AQP4參與了腦缺血再灌注（cerebral ischemic reperfusion，CIR）后腦水腫的形成[2]。研究發現AQP4的作用機制與G蛋白有關，而蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是G蛋白信號通路的中心分子之一，PKC或PKC的激活劑可以抑制AQP4的表達[3]；但也有實驗證明，在腦損傷后，PKC表達水平升高，促使興奮性氨基酸、自由基等的釋放，加重神經元缺血性損害，直接參與并加重了腦水腫的形成[4]。為此，我們以大鼠大腦中動脈缺血（MCAO）再灌注模型為研究對象，研究AQP4、PKC在不同時相上的動態變化與腦水腫的關系，來闡明兩者在腦水腫中的作用和相互關系。

1材料與方法

1.1試驗動物及分組：由南京青龍山實驗動物養殖中心提供，健康雄性SD大鼠72只，鼠齡3～4個月，體重在280～330g，等級：cl，術中、術后死亡或神經功能評分未達要求者由備用組補充，具體分組見表1。

1.3方法：線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞缺血再灌注（MCAO/R）模型，缺血2h后，恢復再灌注，假手術組行相同手術，但置入線栓深度小于10mm。參照Garcia JH[5]的方法對所有實驗大鼠進行神經功能評分，最高評分為18分、最低為3分；采用Elliot公式計算腦組織含水量，腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%；采用SABC法行免疫組織化學染色，結果判定依據染色強度和陽性目標的數量不同進行評分，評分分為0～7、共8個等級。

1.4統計學處理：應用SPSS17.0版統計軟件進行統計學處理，實驗數據以（x-±s）表示，多組均數間的比較采用單因素方差分析，方差不齊時，用Tamhane's T2檢驗。均數間的兩兩比較采用q檢驗，雙變量關系采用直線相關分析，顯著性水準均為α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果實驗數據結果見表2：假手術組與正常對照組AQP4水平差異無統計學意義（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出現了降低，CIR 12h起水平逐漸升高，24h時明顯升高，與正常腦組織水平的差異具有統計學意義（P<0.05）；至CIR 3d時達到峰值，至第5d雖有所下降，但仍維持在較高水平；神經功能缺損評分自CIR 6h即明顯下降，腦含水量在CIR 12h改變明顯（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已經有明顯升高，持續至第5天仍保持較高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情況下，水腫就已經明顯發生，提示此時參與腦水腫形成的可能主要是PKC。

3討論AQP4常表達于星形膠質細胞和室管膜細胞，尤其是與毛細血管和軟腦膜接觸的膠質細胞膜處，參與了腦缺血/出血、腦創傷及腦腫瘤等繼發的腦水腫的形成過程，但有關實驗結果及機制的觀點一直存在爭議。近幾年的諸多實驗的結果逐漸趨向認為AQP4在缺血后腦水腫中表達增多可加重腦水腫，表達減少可減輕腦水腫[6]。關于AQP4表達的調節亦不很清楚，實驗發現內皮素、鎂離子、黃體酮、鈣離子、氯醌、丙泊酚及煙酰胺等藥物可對其發揮調節作用[7，8]，但最有說服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通過磷酸化的方式調節AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的變化，發現缺血20min再灌注早期，海馬區放射活性明顯增高，再灌注6～12h放射活性達最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜轉移現象，即細胞膜的PKC活性升高，而細胞漿的活性相對下降，推測是機體的保護性應激反應，為膜的易位激活，考慮到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此時的AQP4水平也出現了降低，更能顯現出PKC對AQP4活性的抑制，使我們可以推測出其膜轉移的意義在于自身調控AQP4的表達，減輕腦水腫，為機體保持最適宜的內環境。但PKC激活后可促進興奮性氨基酸釋放，加重神經元缺血性損害，可引起細胞源性腦水腫。結合本實驗，PKC在CIR損傷的病理生理機制中可能扮演的角色：在CIR早期機體通過自身調節PKC表達增加，通過磷酸化的方式使AQP4失活，減輕腦水腫，是一種保護性反應，過早抑制PKC可能加重腦水腫，正如諸多學者發現，早期使用鈣離子拮抗劑如尼莫地平，并不能減少AQP4表達，不能減輕腦水腫，因PKC是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白激酶，隨缺血再灌注時間的延長，各種損傷因子持續作用以及神經元細胞壞死，超出機體代償范圍，PKC不能有效地減少AQP4表達，AQP4增多，致血腦屏障破壞，引起嚴重的血管源性腦水腫，也就是早期以細胞源性腦水腫為主，后期以血管源性水腫為主，同時伴隨細胞源性腦水腫。通過PKC激活劑可減少AQP4表達，但能否減輕腦水腫尚待進一步研究。

參考文獻

[1]汪匯，方帆，江華.AQP4在中樞神經系統中作用的研究進展[J].中華神經醫學雜志，2012，（5）：531-534.

[2]Tait MJ， Saadoun S， Bell BA， et al. Increased brain edema in AQP4_null mice in an experimental model of subarachnoid hemorrhage[J]. Neuroscience，2010，167（1）：60-67.

[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.

[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.

[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.

[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.

[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.

[8]陳應柱，張嫻嫻，沈雪.丁基苯酞對放射性腦損傷模型大鼠皮質AQP4表達影響的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，（2）：93-96.

[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.

（收稿日期：2014_6_23）

1.4統計學處理：應用SPSS17.0版統計軟件進行統計學處理，實驗數據以（x-±s）表示，多組均數間的比較采用單因素方差分析，方差不齊時，用Tamhane's T2檢驗。均數間的兩兩比較采用q檢驗，雙變量關系采用直線相關分析，顯著性水準均為α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果實驗數據結果見表2：假手術組與正常對照組AQP4水平差異無統計學意義（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出現了降低，CIR 12h起水平逐漸升高，24h時明顯升高，與正常腦組織水平的差異具有統計學意義（P<0.05）；至CIR 3d時達到峰值，至第5d雖有所下降，但仍維持在較高水平；神經功能缺損評分自CIR 6h即明顯下降，腦含水量在CIR 12h改變明顯（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已經有明顯升高，持續至第5天仍保持較高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情況下，水腫就已經明顯發生，提示此時參與腦水腫形成的可能主要是PKC。

3討論AQP4常表達于星形膠質細胞和室管膜細胞，尤其是與毛細血管和軟腦膜接觸的膠質細胞膜處，參與了腦缺血/出血、腦創傷及腦腫瘤等繼發的腦水腫的形成過程，但有關實驗結果及機制的觀點一直存在爭議。近幾年的諸多實驗的結果逐漸趨向認為AQP4在缺血后腦水腫中表達增多可加重腦水腫，表達減少可減輕腦水腫[6]。關于AQP4表達的調節亦不很清楚，實驗發現內皮素、鎂離子、黃體酮、鈣離子、氯醌、丙泊酚及煙酰胺等藥物可對其發揮調節作用[7，8]，但最有說服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通過磷酸化的方式調節AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的變化，發現缺血20min再灌注早期，海馬區放射活性明顯增高，再灌注6～12h放射活性達最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜轉移現象，即細胞膜的PKC活性升高，而細胞漿的活性相對下降，推測是機體的保護性應激反應，為膜的易位激活，考慮到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此時的AQP4水平也出現了降低，更能顯現出PKC對AQP4活性的抑制，使我們可以推測出其膜轉移的意義在于自身調控AQP4的表達，減輕腦水腫，為機體保持最適宜的內環境。但PKC激活后可促進興奮性氨基酸釋放，加重神經元缺血性損害，可引起細胞源性腦水腫。結合本實驗，PKC在CIR損傷的病理生理機制中可能扮演的角色：在CIR早期機體通過自身調節PKC表達增加，通過磷酸化的方式使AQP4失活，減輕腦水腫，是一種保護性反應，過早抑制PKC可能加重腦水腫，正如諸多學者發現，早期使用鈣離子拮抗劑如尼莫地平，并不能減少AQP4表達，不能減輕腦水腫，因PKC是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白激酶，隨缺血再灌注時間的延長，各種損傷因子持續作用以及神經元細胞壞死，超出機體代償范圍，PKC不能有效地減少AQP4表達，AQP4增多，致血腦屏障破壞，引起嚴重的血管源性腦水腫，也就是早期以細胞源性腦水腫為主，后期以血管源性水腫為主，同時伴隨細胞源性腦水腫。通過PKC激活劑可減少AQP4表達，但能否減輕腦水腫尚待進一步研究。

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[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.

（收稿日期：2014_6_23）

1.4統計學處理：應用SPSS17.0版統計軟件進行統計學處理，實驗數據以（x-±s）表示，多組均數間的比較采用單因素方差分析，方差不齊時，用Tamhane's T2檢驗。均數間的兩兩比較采用q檢驗，雙變量關系采用直線相關分析，顯著性水準均為α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果實驗數據結果見表2：假手術組與正常對照組AQP4水平差異無統計學意義（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出現了降低，CIR 12h起水平逐漸升高，24h時明顯升高，與正常腦組織水平的差異具有統計學意義（P<0.05）；至CIR 3d時達到峰值，至第5d雖有所下降，但仍維持在較高水平；神經功能缺損評分自CIR 6h即明顯下降，腦含水量在CIR 12h改變明顯（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已經有明顯升高，持續至第5天仍保持較高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情況下，水腫就已經明顯發生，提示此時參與腦水腫形成的可能主要是PKC。

3討論AQP4常表達于星形膠質細胞和室管膜細胞，尤其是與毛細血管和軟腦膜接觸的膠質細胞膜處，參與了腦缺血/出血、腦創傷及腦腫瘤等繼發的腦水腫的形成過程，但有關實驗結果及機制的觀點一直存在爭議。近幾年的諸多實驗的結果逐漸趨向認為AQP4在缺血后腦水腫中表達增多可加重腦水腫，表達減少可減輕腦水腫[6]。關于AQP4表達的調節亦不很清楚，實驗發現內皮素、鎂離子、黃體酮、鈣離子、氯醌、丙泊酚及煙酰胺等藥物可對其發揮調節作用[7，8]，但最有說服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通過磷酸化的方式調節AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的變化，發現缺血20min再灌注早期，海馬區放射活性明顯增高，再灌注6～12h放射活性達最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜轉移現象，即細胞膜的PKC活性升高，而細胞漿的活性相對下降，推測是機體的保護性應激反應，為膜的易位激活，考慮到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此時的AQP4水平也出現了降低，更能顯現出PKC對AQP4活性的抑制，使我們可以推測出其膜轉移的意義在于自身調控AQP4的表達，減輕腦水腫，為機體保持最適宜的內環境。但PKC激活后可促進興奮性氨基酸釋放，加重神經元缺血性損害，可引起細胞源性腦水腫。結合本實驗，PKC在CIR損傷的病理生理機制中可能扮演的角色：在CIR早期機體通過自身調節PKC表達增加，通過磷酸化的方式使AQP4失活，減輕腦水腫，是一種保護性反應，過早抑制PKC可能加重腦水腫，正如諸多學者發現，早期使用鈣離子拮抗劑如尼莫地平，并不能減少AQP4表達，不能減輕腦水腫，因PKC是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白激酶，隨缺血再灌注時間的延長，各種損傷因子持續作用以及神經元細胞壞死，超出機體代償范圍，PKC不能有效地減少AQP4表達，AQP4增多，致血腦屏障破壞，引起嚴重的血管源性腦水腫，也就是早期以細胞源性腦水腫為主，后期以血管源性水腫為主，同時伴隨細胞源性腦水腫。通過PKC激活劑可減少AQP4表達，但能否減輕腦水腫尚待進一步研究。

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[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.

[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.

[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.

[8]陳應柱，張嫻嫻，沈雪.丁基苯酞對放射性腦損傷模型大鼠皮質AQP4表達影響的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2013，（2）：93-96.

[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.

（收稿日期：2014_6_23）