缺血性卒中模型選擇及臨床前實驗設計

王群，王擁軍

缺血性卒中由于病因、病程、阻塞部位、缺血程度及合并系統疾病的差異而導致臨床變異性很大，使得臨床研究需要較多的樣本量以避免混雜因素的影響，而這些可變量在動物模型中可以得到嚴格控制[1]。實驗性腦缺血模型已經被用來模擬人類卒中，它在認識缺血性腦損傷的病理機制，發展新的治療策略方面發揮著重要作用[2]。缺血性卒中的治療策略可以分為兩個主要方面：溶栓和神經保護。目前，重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一獲得美國食品藥品管理局批準的急性缺血性卒中的治療藥物，其溶栓療效首先在實驗性動物模型中得到證實[3]。盡管在動物模型中，許多藥物顯示有神經保護作用，但從動物到臨床的轉化研究中則未能顯示同樣的效果[4]，可能與動物模型不能真正代表疾病的狀態[5]或藥物在動物和患者身上的應用差異有關[6]。

為了解決這一困惑，美國第一屆卒中治療學術工業圓桌會議（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）規范了臨床前期實驗的統一標準，對藥物治療的劑量、時間窗、動物選擇、模型選擇、生理指標監測和療效評定進行了界定。臨床前研究應首先在嚙齒類小型動物中進行，而相關藥物研究還應該考慮在多腦回的靈長類大動物中展開[7]。第六屆STAIR對此規范進行了補充升級[8-9]：①消除在動物隨機化和療效評估中的偏見；②制訂動物入組和排除標準；③適當的統計學方法計算動物樣本數；④公布潛在的利益沖突；⑤在年幼、健康和雄性動物完成起始實驗后，應進一步選擇雌性、老齡和伴隨高血壓、糖尿病和高血脂的動物進行實驗[10]；⑥在動物研究中應用與臨床相關的生物指標。

一個可靠的缺血性卒中模型必須能夠誘導高度一致的腦損傷，避免其他因素影響結果判定，并能被廣泛利用。為此美國實驗卒中協會于2009年為卒中的臨床前期實驗公布了第一版卒中模型指南。在開始臨床前期卒中實驗以前，要求遵守以下步驟[11]：①復習最近的STAIR標準以期達到最佳的研究設計；②選擇最適當的卒中模型；③確定卒中模型的參數，如預期的梗死灶大小和手術程序；④確定麻醉方法；⑤確定吸入氣體的成分；⑥確定插管和通氣的必要性和設置；⑦建立動脈血壓、血氣和血糖監測；⑧建立體溫監測和維持；⑨建立區域性腦血流監測；⑩確定術后動物照料規程； 確定梗死灶體積測量的方法和時間； 確定功能缺失評估的實驗方法和時間； 通過預實驗調整實驗設置到最優化； 以藥物非臨床研究質量管理規范（good laboratory practice，GLP）評估實驗的順應性。

在可靠的實驗模型中何時開始評價，如何評價治療策略，針對這個問題，以往大多數的局灶性腦缺血損傷是在急性期即在缺血24 h檢查組織病理結果。然而由于遲發性腦損傷及神經再生的發展，STAIR建議神經保護劑的結果評價應該包括急性期（1～3 d）和長時程（1～4周）評估[7]。評價缺血性神經損傷的方法很多，STAIR建議至少應該考慮兩種評價方法，即組織病理改變和功能反應[7，12]?，F對常用的評價方法做一介紹。

1 區域腦血流監測

激光多普勒血流分析儀，可將激光探頭固定于顱骨上，只要保證激光探頭在整個實驗過程中無位置移動及轉動，即可準確地測定該部位的血流量[13-14]。應用激光多普勒監測局灶和全腦缺血的腦血流量，只有當區域腦血流監測平均降低70%～80%時才能符合模型成功標準[14-15]。

2 腦電圖記錄

腦電圖較神經影像對腦缺血更敏感，反應更早[16-17]。分別在動物顱骨的左右兩側對稱地放置腦電極，電極尖端穿過顱骨接觸硬腦膜，用牙科黏合劑固定，參考電極安置在鼻骨正中?？梢苑从匙钄鄠却竽X中動脈供血區、非供血區以及對側相應部位的腦電變化。若應用腦電圖儀，可放置更多的電極，能更準確地反映腦缺血的范圍以及程度。缺血區腦電圖出現波幅降低，頻率減慢。記錄并測量栓塞前、栓塞后和復灌后的腦電圖的波幅。通常將腦電圖變化依其幅度下降程度分為Ⅳ級。Ⅰ級：無改變，原水平的75%以上；Ⅱ級：輕度抑制，原水平的50%～75%；Ⅲ級：中度抑制，原水平的25%～50%；Ⅳ級：嚴重抑制，原水平的25%至等電位。

3 行為學評價

功能恢復是臨床藥物研究的最終目標[18-19]，因此選取何種指標評價腦缺血的程度及藥物的療效尤為重要。為了減少主觀偏見，采用盲法評估功能反應很有必要[11]。必要時行為學測試應該安排在腦缺血1個月后進行[7]。

3.1 神經功能缺損評估 模型制備成功后會出現相應的癥狀與體征，這些癥狀與體征反映了腦損傷與恢復的程度，可作為模型成功的標志。神經功能分級通常用來量化神經功能缺失評估。其分級必須能夠檢查腦缺血誘導的運動、感覺、運動協調、自發性活動、反射、意識和警覺變化。一般采用Zea Longa[20]、Bederson[21]、Rogers[22]分數量表法按受損程度分級。如Zea Longa 5分制評分標準為[20]：0分，無神經損害的癥狀；1分，不能伸展對側前爪；2分，向外側轉圈；3分，向對側傾倒：4分，不能自發行走，意識喪失。

3.2 大鼠記憶定位功能評價 動物腦中參與學習和記憶的部位不僅限于海馬，皮質尤其是頂葉皮質在動物的學習和記憶過程中起到非常重要的作用，術后頂葉皮質的損傷會導致大鼠的學習記憶能力降低。對此常用的檢測方法為水迷宮試驗[23]。

3.3 運動協調能力評價 運動的調控是在運動系統分級調控的基礎上通過反饋機制調整緩慢的運動或姿勢的維持，通過前饋控制來控制快速的動作。常用的方法有攀繩實驗[24]和肢體對稱試驗[25]等。

4 腦表面血管的觀察

印度墨汁-明膠溶液心內注射后隨腦血流入腦循環。在顯微鏡下可清晰顯示腦表面的血管結構、大小及走向。結合激光多普勒監測腦血流，可以剔除具有后交通動脈的動物，從而提高結果的一致性[15，26]。

5 梗死灶大小測量

動物斷頭取腦，冠狀位切片，迅速將腦片置于2，4，5-三苯基四氮唑染液中，37℃避光溫孵30 min，取出后置于10%甲醛溶液中避光保存24 h，經染色后非缺血區為玫瑰紅色，梗死區為白色?？梢詫δX片進行計算機圖像分析，觀察計算大鼠腦梗死灶的范圍[27]。

6 白細胞、血小板與血管內皮細胞黏附反應

腦微循環研究的進展依賴于尖端技術的進步。現在通過高性能的熒光顯微鏡和高靈敏度的錄像和快速圖像處理系統（Intravital Fluorescence Microscopy and Video Analysis），已能對腦微循環內循環細胞和內皮細胞之間的作用進行直接動態活體觀察、測量和分析[28-29]。一般先通過靜脈注射熒光物質標記白細胞或血小板，然后應用該系統并結合顱骨窗技術，對軟腦膜微循環中白細胞或血小板的滾動（rolling）、黏附（adhesion）和其與內皮細胞的接觸時間（adhesive contact time）進行研究[30]，旨在了解神經保護劑對腦缺血再灌注引起的腦微循環障礙的影響。

7 血腦屏障通透性

動物尾靜脈注射偶氮藍溶液，制作腦缺血模型后斷頭取腦。然后將腦放入盛有甲酸胺溶液的試管中浸泡。取出后用分光光度計進行浸出液比色，測定光密度。再以標準曲線對照，繼而計算出單位腦重的偶氮藍含量，以此評價血腦屏障通透性[31]。

8 腦水腫測量[32]

通過腦水腫的測量觀察腦缺血損傷后腦組織水腫情況。一般在缺血模型復制后24 h，快速剝出鼠腦，將左右大腦半球分別稱重，然后置烤箱內烤干至恒重（5 d后兩次檢查）。分別稱量大腦半球干重，按以下公式計算大腦半球的含水量。含水量（%）=（濕重－干重）／濕重×100%。

9 組織病理改變

蘇木精伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）和甲酚紫（Cresyle violet）染色是傳統的組織病理檢查方法，可以精確可靠地區別梗死組織和正常組織，損傷神經元和正常神經元，是鑒別梗死灶和損傷神經元的金標準[15，33-34]。可采用光學顯微鏡或電子顯微鏡研究鏡下的組織細胞形態學改變。Flouro-Jade B組織熒光染色陽性說明神經元變性損傷。原位末端標記（Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end Labeling assay，TUNEL）組織染色是確定神經元程序性死亡（凋亡）的金標準[35]。微管相關蛋白-2免疫組織化學染色可以觀察神經元突起的損傷狀況[36]。另外，利用雙光子顯微技術（2-photon microscopy）也可以在活體卒中動物模型中檢測到精細的突觸動態結構變化[37]。

10 神經生化測定

取腦組織稱重后制成勻漿，取離心后上清液采用相應的方法，檢測各項指標腦組織內神經遞質、血管活性物質及其他生物活性物質[31，36]。亦可活體收集微透析液，與高效液相色譜或毛細血管電泳儀連用，觀測腦組織神經遞質等神經活性物質的動態變化[38]。

11 蛋白和基因表達的檢測

應用免疫組化、蛋白印跡或蛋白質組學方法檢測腦內重要功能蛋白的含量[39-40]。采用原位聚合酶鏈反應、原位雜交或其他雜交方法及基因組學方法，可觀察基因的表達[41-43]。不僅有利于對腦缺血病理生理機制的深入探討，而且有利于對神經保護劑確切療效的評價。

12 神經影像

國外研究[44]已將磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）彌散加權像（diffusion weighted imaging，DWI）和T1、T2加權像用于大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型研究。DWI在缺血損害的早期階段，就能區分缺血組織與正常組織，從而早期進行模型評價[45]。MRI灌注加權像（perfusion weighted imaging，PWI）可檢測局部腦血容量、局部腦血流量等生理和血流動力學資料。DWI及PWI能在腦缺血早期顯示病灶大小和部位，DWI反映的是腦細胞損傷的病理狀態，PWI反映了血流動力學的變化[46]。且MRI具備無創傷性的特點，可以動態觀測大鼠腦缺血損害的時間變化趨勢以及梗死灶的大小。近年來，分子圖像廣泛應用于嚙齒類動物腦缺血研究。采用MRI分子圖像技術成功在小鼠MCAO模型中檢測到血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達，腦的預適應保護減少了腦缺血再灌注誘導的VCAM-1表達，改善了行為異常[47]。提示分子MRI技術可用于病情評估及治療監測。最近，微小計算機斷層掃描（micro-computed tomography，micro-CT）被應用于嚙齒類動物腦缺血研究[48]，其圖像的空間和對照分辨率及用于梗死灶體積測量的精確性與MRI相當[49]。

鑒于缺血性腦血管疾病發病率高且是現今醫藥研究課題的重點、熱點，我們在基礎醫學研究以及評價各類藥物、化合物的藥理作用，分析其作用機理的研究中，難免會經常使用各種缺血性腦血管疾病動物模型和不同評價缺血性神經損傷的方法。模型選擇必須按照課題研究的要求，選定與人類腦缺血性疾病發病機制等接近的動物模型，確定對臨床研究或藥效藥理研究有明確指導意義的評價缺血性神經損傷的指標，以達到研究目的。全面考慮各種因素對模型的影響，建立重復性好，生理指標控制嚴格的標準化腦缺血動物模型并選用急性期和長時程評價指標，是研究缺血性腦損傷及腦保護必不可少的工具。

1 Durukan A, Tatlisumak T. Acute ischemic stroke：Overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2007, 87：179-197.

2 Macrae IM. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia[J]. Br J Pharmacol, 2011, 164：1062-1078.

3 del Zoppo GJ. Relevance of focal cerebral ischemia models. Experience with fibrinolytic agents[J]. Stroke,1990, 21：IV155-IV160.

4 Willing AE. Experimental models：Help or hindrance.Stroke, 2009, 40：S152-S154.

5 Slikkker W, Youdim M, Palmer GC, et al. The future of neuroprotection[J]. Ann N Y Acad Sci, 1999, 890：529-533.

6 Richard Green A, Odergren T, Ashwood T. Animal models of stroke：Do they have value for discovering neuroprotective agents?[J]. Trends Pharmacol Sci, 2003,24：402-408.

7 Saver JL, Albers GW, Dunn B,et al. STAIR VI Consortium. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR). Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development[J]. Stroke, 1999, 30：2752-2758.

8 Fisher M, Feuerstein G, Howells DW, et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations[J]. Stroke, 2009, 40：2244-2250.

9 Macleod MR, Fisher M, O'Collins V, et al. Good laboratory practice：Preventing introduction of bias at the bench[J]. Stroke, 2009, 40：e50-e52.

10 Fan X, Qiu J, Yu Z, et al. A rat model of studying tissuetype plasminogen activator thrombolysis in ischemic stroke with diabetes[J]. Stroke, 2012, 43：567-570.

11 Liu S, Zhen G, Meloni BP, et al. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition)[J]. J Exp Stroke Transl Med, 2009, 2：2-27.

12 Durukan A, Strbian D, Tatlisumak T. Rodent models of ischemic stroke：A useful tool for stroke drug development[J]. Curr Pharm Des, 2008, 14：359-370.

13 Harada H, Wang Y, Mishima Y, et al. A novel method of detecting rcbf with laser-Doppler flow metry without cranial window through the skull for a MCAO rat model[J]. Brain Res Brain Res Protoc, 2005, 14：165-170.

14 Prieto R, Carceller F, Roda JM, et al. The intraluminal thread model revisited：Rat strain differences in local cerebral blood flow[J]. Neurol Res, 2005, 27：47-52.

15 Wang Q, Xu J, Rottinghaus GE, et al. Resveratrol protects against global cerebral ischemic injury in gerbils[J]. Brain Res, 2002, 958：439-447.

16 Kohno K, Back T, Hoehn-Berlage M, et al. A modified rat model of middle cerebral artery thread occlusion under electrophysiological control for magnetic resonance investigations[J]. Magn Reson Imaging, 1995,13：65-71.

17 Huang L, Wang Y, Liu J, et al. Approximate entropy of eeg as a measure of cerebral ischemic injury[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2004, 6：4537-4539.

18 Schaar KL, Brenneman MM, Savitz SI. Functional assessments in the rodent stroke model[J]. Exp Transl Stroke Med, 2010, 2：13.

19 Zarruk JG, Garcia-Yebenes I, Romera VG, et al.Neurological tests for functional outcome assessment in rodent models of ischaemic stroke[J]. Rev Neurol, 2011,53：607-618.

20 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20：84-91.

21 Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion：Evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke,1986, 17：472-476.

22 Rogers DC, Campbell CA, Stretton JL, et al. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J]. Stroke, 1997, 28：2060-2066.

23 D'Hooge R, De Deyn PP. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory[J].Brain Res Brain Res Rev, 2001, 36：60-90.

24 Ding Y, Zhou Y, Lai Q, et al. Long-term neuroprotective effect of inhibiting poly(adp-ribose) polymerase in rats with middle cerebral artery occlusion using a behavioral assessment[J]. Brain Res, 2001, 915：210-217.

25 Bland ST, Schallert T, Strong R, et al. Early exclusive use of the affected forelimb after moderate transient focal ischemia in rats：Functional and anatomic outcome[J].Stroke, 2000, 31：1144-1152.

26 Zhen G, Dore S. Optimized protocol to reduce variable outcomes for the bilateral common carotid artery occlusion model in mice[J]. J Neurosci Methods, 2007,166：73-80.

27 Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, et al. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats[J]. Stroke, 1986, 17：1304-1308.

28 Gavins F, Yilmaz G, Granger DN. The evolving paradigm for blood cell-endothelial cell interactions in the cerebral microcirculation[J]. Microcirculation, 2007,14：667-681.

29 Ishikawa M, Zhang JH, Nanda A, et al. Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in the cerebral microcirculation[J]. Front Biosci, 2004, 9：1339-1347.

30 Wang Q, Kalogeris TJ, Wang M, et al. Antecedent ethanol attenuates cerebral ischemia/reperfusioninduced leukocyte-endothelial adhesive interactions and delayed neuronal death：role of large conductance Ca2+-actinated K+channels[J]. Microcirculation, 2010, 17：427-438.

31 Gidday JM, Gasche YG, Copin JC, et al. Leukocytederived matrix metalloproteinase-9 mediates bloodbrain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 289：H558-H568.

32 Yang G, Chan PH, Chen SF, et al. Reduction of vasogenic edema and infarction by mk-801 in rats after temporary focal cerebral ischemia[J]. Neurosurgery,1994, 34：339-345.

33 Lin TN, Wang Q, Simonyi A, et al. Induction of secretory phospholipase a2 in reactive astrocytes in response to transient focal cerebral ischemia in the rat brain[J]. J Neurochem, 2004, 90：637-645.

34 Garcia JH, Liu KF, Ho KL. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex[J]. Stroke, 1995, 26：636-643.

35 Wang Q, Sun AY, Simonyi A, et al. Oral administration of grape polyphenol extract ameliorates cerebral ischemia/reperfusion-induced neuronal damage and behavioral deficits in gerbils：Comparison of pre- and post-ischemic administration[J]. J Nutr Biochem, 2009,20：369-377.

36 Wang Q, Sun AY, Simonyi A, et al. Ethanol preconditioning protects against ischemia/reperfusioninduced brain damage：Role of NADPH oxidase-derived ros[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 43：1048-1060.

37 Sigler A, Murphy TH. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain：Before, during, and after stroke[J]. Stroke, 2010, 41：S117-S123.

38 Van Hemelrijck A, Sarre S, Smolders I, et al.Determination of amino acids associated with cerebral ischaemia in rat brain microdialysates using narrowbore liquid chromatography and fluorescence detection[J]. J Neurosci Methods, 2005, 144：63-71.

39 Barone FC, White RF, Spera PA, et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance：Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression[J]. Stroke, 1998, 29：1937-1950,discussion 1950-1931.

40 Datta A, Jingru Q, Khor TH, et al. Quantitative neuroproteomics of an in vivo rodent model of focal cerebral ischemia/reperfusion injury reveals a temporal regulation of novel pathophysiological molecular markers[J]. J Proteome Res, 2011, 10：5199-5213.

41 Iadecola C, Ross ME. Molecular pathology of cerebral ischemia：Delayed gene expression and strategies for neuroprotection[J]. Ann N Y Acad Sci, 1997, 835：203-217.

42 Slevin M, Krupinski J, Kumar P, et al. Gene activation and protein expression following ischaemic stroke：Strategies towards neuroprotection[J]. J Cell Mol Med, 2005, 9：85-102.

43 Stenzel-Poore MP, Stevens SL, Simon RP. Genomics of preconditioning[J]. Stroke, 2004, 35：2683-2686.

44 Hoehn M, Nicolay K, Franke C, et al. Application of magnetic resonance to animal models of cerebral ischemia[J]. J Magn Reson Imaging, 2001, 14：491-509.

45 Sevick RJ, Kucharczyk J, Mintorovitch J, et al. Diffusionweighted MR imaging and T2-weighted MR imaging in acute cerebral ischaemia：Comparison and correlation with histopathology[J]. Acta Neurochir Suppl (Wien),1990, 51：210-212.

46 Tatlisumak T, Strbian D, Abo Ramadan U, et al. The role of diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in drug development for ischemic stroke：From laboratory to clinics[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2004,2：343-355.

47 Hoyte LC, Brooks KJ, Nagel S, et al. Molecular magnetic resonance imaging of acute vascular cell adhesion molecule-1 expression in a mouse model of cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2010, 30：1178-1187.

48 McLeod DD, Parsons MW, Levi CR, et al. Establishing a rodent stroke perfusion computed tomography model[J].Int J Stroke, 2011, 6：284-289.

49 Hayasaka N, Nagai N, Kawao N, et al. In vivo diagnostic imaging using micro-CT：Sequential and comparative evaluation of rodent models for hepatic/brain ischemia and stroke[J]. PLoS One, 2012, 7：e32342.