腦缺血預適應標志物的評估

蘇芳，朱雨嵐，郭安臣，王擁軍1，，王群1，

腦缺血是世界范圍內首要的致殘及致死原因之一[1]。動物研究發現大量神經保護因子有效，但臨床試驗均無效。因此，人們致力于探索腦缺血的新的治療策略，其中缺血預適應（ischemic preconditioning，IPC）受到廣泛的關注。腦缺血預適應是對抗缺血性腦血管疾病的細胞保護策略，它通過短暫的缺血誘導固有的防御系統，引起對隨后的嚴重缺血的耐受。例如，短暫阻斷頸內動脈可保護隨后的長時缺血并縮小梗死體積；遠程IPC可保護遠隔器官的更嚴重的缺血[2]。發現可能影響IPC的效應器及因子是IPC發展為臨床試驗的非常理想的目標。確定適合的標志物以表明預適應反應的誘發是轉化研究的重點。因此，全面系統地研究缺血耐受的機體特點，從而確定發展適合的標志物，以表明神經保護治療成功轉化，具有重要的理論及臨床意義。本文將對IPC的機制及可能的生物學標志物予以綜述。

1 缺血預適應的保護機制

IPC是一種內源性神經保護機制，它誘導的缺血耐受存在于包括人、大鼠、小鼠、兔和豬等多種生物以及腦、肝臟、心臟、腎臟和脊髓等多種器官，這也證明了預適應反應的普遍性[3-6]。眾所周知，IPC激活了廣泛的不同的保護機制并且可抑制潛在的有害通路[7-8]。如IPC可以激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs），而TLR預處理可通過減少循環血中白細胞的活化、淋巴細胞對內皮的黏附、中性粒細胞的滲出、小膠質細胞的激活等減輕局灶腦缺血后的炎癥反應而發揮保護作用[9]。其他研究在大鼠腦、心臟等靶組織發現了多種反應，例如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）的表達，腺苷受體、一氧化氮代謝的上調等，并且將這些反應與組織保護關聯[10-11]。總之，IPC誘導的保護作用基于以下幾方面：細胞代謝穩態的改變[12]；線粒體代謝的調節[4]；防護興奮性毒性損傷及缺氧/缺血去極化[13]；通過離子轉運系統改善容量以保護細胞離子穩態及pH穩態[14]；抑制凋亡機制[15]；激活脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）修復及自我修復[16]；抑制炎癥反應[17]；調節缺血再灌注階段的血流及血管重塑[18]。

IPC可以分為發生于亞致死性損傷后數分鐘并持續幾小時的早期階段及發生在24～48 h后持續數天至數周的晚期階段[19]，這兩階段有不同的保護機制。預適應反應開始階段包括許多觸發機制，如細胞因子[20]、腺苷受體[21]、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）-敏感鉀通道[22]及氧化應激等。IPC后早期再灌注，神經保護反應通過蛋白轉錄后修飾快速啟動，晚期階段依賴于基因表達和蛋白質的從頭合成[19]，而晚發階段新合成的蛋白質有可能成為神經保護治療成功的標志物。

這些臨床前研究，明確了預適應反應的重要通路，但它們很難作為預適應反應的標志物，因為它們大多需要直接有創的組織檢測，而這些很難在人腦、心臟等器官實現，但它們為臨床標志物的進一步發展和試驗指明了方向并提供了理論依據。

2 臨床缺血預適應模型

大部分在體IPC模型是嚙齒類動物模型，通常是有創的，很難轉化成臨床應用。然而，一種IPC改進的形式——遠隔缺血預適應（remote ischemic preconditioning，RIPC）被證明具有高度的轉化價值[23]。RIPC包括周期性暫時阻斷和再恢復遠離細胞保護靶器官的肢體血流。在這一區域反復的周期性暫時缺血可以觸發可溶性保護因子釋放入血液，并分布到靶器官發揮保護作用[24]。如，臨床試驗使用血壓袖帶暫時阻斷和恢復患者上肢或大腿血流，因此稱為RIPC模型之一[25]。RIPC處理后的冠狀動脈旁路移植術患者，射血分數、移植物通暢及心電圖參數均有所改善[26]。研究證實RIPC在嚴重蛛網膜下腔出血患者中也是安全且耐受的[6]，因此RIPC可能是一種易行的預防性治療方法。RIPC確切的保護機制尚不清楚。

3 臨床缺血預適應生物標志物的評估

缺血耐受狀態生物標志物的發展具有重大的臨床和科學意義，基于以往實驗確定的信號通路及機制，人們已經開始評估人類對預處理的生物反應。而卒中時預適應反應可能標志物的臨床研究相對較少。鑒于預適應眾多的生物學作用，識別血清標志物、確定缺血耐受狀態的存在似乎是可能的。血清標志物易于檢測，可重復，并且可商業化，有較好的臨床應用前景，一直以來都是研究的熱點。迄今為止大多數的臨床研究通過研究血清止血、內皮細胞功能、炎癥反應及影像學標志等來評估人類對預適應的反應。

3.1 止血標志物 研究表明預適應對涉及凝血級聯反應的止血、纖溶支持蛋白的基因表達有廣泛的作用，這些蛋白可作為預適應反應潛在的標志物[27]。在健康志愿者蛋白質組研究中，Hepponstall等[28]對5位健康志愿者上肢進行4次（每次5 min）循環的缺血預處理，涉及止血、免疫反應、抗炎、氧化應激抑制、內皮細胞活化等多種蛋白質的表達發生了改變。例如，RIPC組纖維蛋白原β（fibrinogen beta，Fgβ）下調，而Fgβ是止血蛋白，可以促進缺血再灌注時血小板的黏附，它的下調可能與RIPC的保護作用有關，因此Fgβ可能作為IPC潛在的標志物。Pedersen等[29]對22例健康志愿者進行上肢3次（每次5 min）循環缺血預處理，結果發現預處理不影響血清纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）和tPA抑制劑抗原及活性。但是該研究給予預處理刺激及進行血清分析的時間間隔相對較短（缺血預處理30 min內給予評估），如延長分析時間，預適應對這些蛋白的延遲作用仍可能存在。還有研究表明，RIPC可抑制人缺血再灌注損傷相關的血小板的活化[30]。Oberkofler等[31]在鼠的研究中發現血小板-血清素-血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-白細胞介素（interleukin，IL）-10/基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinste，MMP）-8軸介導了RIPC的保護作用。而血小板活化的標記是否能可靠地衡量預適應反應尚需進一步的研究確認。

3.2 內皮及血管活性因子 Park等[32]對沙土鼠的研究發現，IPC可顯著增強缺血再灌注后CA1區錐體細胞VEGF的誘導及其受體的免疫活性，該研究提示VEGF的表達增加可能對于短暫性缺血性損傷細胞的存活是必需的。Kimura等[33]評估了IPC對血管活性和內皮因子的影響，健康志愿者接受為期1個月，每天4次（每次5 min）重復的前臂缺血預適應，發現IPC可引起血漿VEGF水平及內皮祖細胞升高，提示重復的IPC刺激可增強內皮依賴的血管舒張，IPC是周圍血管保護的一個簡單、安全易行的治療技術，而血漿VEGF的升高可作為預適應反應發生的潛在的標志物。還有學者提出了一些血管活性物質例如一氧化氮的活化、緩激肽等介導了IPC反應，但由于這些物質難于檢測，目前少有關于預適應如何影響這些物質水平的臨床研究。

3.3 炎癥標志物 大部分評估人類預適應反應的臨床工作僅涉及免疫和炎癥系統。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）過表達與腦梗死前短暫缺血中實驗性缺血耐受相關。Castillo等[34]檢測了283例腦梗死患者癥狀出現后24 h內血漿TNF-α及IL-6的濃度。其中卒中前72 h內短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）的患者38例，腦梗死的體積及預后（Barthel指數）均顯著低于無前驅TIA的患者。有前驅TIA的患者，血漿TNF-α升高、IL-6降低。當TNF-α高于30 pg/ml，IL-6低于30 pg/ml，認為一個新的變量TNF-α/IL-6指數為陽性，陽性TNF-α/IL-6指數存在于92%的腦梗死前患有TIA患者，而腦梗死前無TIA的患者中僅1%。TNF-α/IL-6指數增高與腦梗死預后的改善相關。Saxena等[35]對冠狀動脈旁路移植術患者術前上肢缺血預處理，結果發現可以下調中性粒細胞激肽B1和B2受體的表達，但血漿C反應蛋白無明顯變化。目前少有臨床試驗檢測腦缺血預處理中C反應蛋白等的變化，有待進一步的研究。

3.4 其他血清標志物 鈣連接蛋白B（S100 calcium binding protein B，S100B）是評估中樞神經系統損傷（腦外傷、腦梗死、脊髓疾病等）嚴重程度的生物標志物之一，也是較早被研究的急性腦梗死的標志物之一。主要由星形膠質細胞分泌，是腦內特異蛋白，生物學功能包括調鈣作用、細胞代謝、抑制磷酸化等。缺血性卒中發生后血清S100B蛋白濃度增加，且與腦梗死體積呈正相關[36]。有研究表明，脊髓型頸椎病患者頸椎減壓術前給予上肢缺血預處理，可降低外周血S100B水平，患者預后較好[37]。關于腦缺血預適應中S100B的變化，其是否能夠反映缺血耐受狀態的發生、是否有較好的劑量-效應關系少有報道，尚需進一步的試驗來評估其是否可作為IPC的敏感、特異的標志物。

微小RNA（microRNA，miRNA），是生物體內具有重要調控作用的非編碼小RNA，在許多病理生理條件下，表達發生改變。缺血耐受需要新蛋白質的合成，引起大腦對隨后的缺血反應的基因重組，miRNA通過直接作用于信使RNA（messenger ribonucleic acid，mRNA）調節轉錄后基因表達。Lusardi等[38]研究表明IPC調節大鼠大腦皮質miRNA表達，提示miRNA作為IPC誘導的缺血耐受的效應器。目前關于人類IPC誘導的缺血耐受狀態下的miRNA表達的變化研究較少，由于血液中miRNA易被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）降解，臨床采集標本需嚴格注意，且RNA提取檢測過程需時較長、費用過高，這些特點限制了其發展，miRNA是否能作為IPC的標志物，尚需進一步研究探索。

3.5 影像學標志物 除血清標志物外，還可通過血流、灌注成像及血管舒縮測試、腦電圖等來評估IPC反應。IPC的重要生理作用包括增加靶器官的血流。在局灶腦缺血動物模型，預處理增加缺血半暗帶區的腦血流。Vlasov等[39]通過高頻多普勒超聲儀探測缺血預處理的缺血再灌注大鼠的腦血流量，結果發現早期和晚期預處理可增加大鼠腦缺血后的腦血流量。數項臨床研究評估了IPC的血流改變，Meng等[40]納入68例癥狀性顱內動脈狹窄患者進行研究，所有患者接受標準的醫療管理，其中38例接受連續300 d，每天2次5個循環反復雙上肢缺血預處理，單電子發射計算機斷層掃描（single photon emission-computed tomography，SPECT）及經顱多普勒檢查發現與對照組比較預處理患者腦灌注及血流增加，300 d時對照組卒中復發率為26.7%，而預處理組僅為7.9%。Jensen及其團隊研究了與臨床非常相關的豬深低溫停循環模型中RIPC的作用，研究發現循環驟停前1 h給予后肢4次（每次5 min）循環的缺血-再灌注，引起腦乳酸降低、腦電圖快速恢復及行為學評分的改善[41]。Gonzalez等[42]最近報道了遠程處理對蛛網膜下腔出血患者發病后2周血管痙攣高峰期血流動力學及腦代謝的作用，在蛛網膜下腔出血后2～12 d對患者進行3～4周期的下肢RIPC，每周期4次（每次5 min）循環的缺血-再灌注，發現RIPC可引起短暫的血管舒張，改善了患者的腦血流動力學（經顱多普勒），降低乳酸/丙酮酸的比例（微量透析）以及丙三醇，改善腦代謝，提示缺血保護及細胞膜保護作用。這將打開在因臨床目的需要進行有創監測的重癥患者中仔細監測對預適應的代謝反應的可能。

綜上所述，發現代表IPC誘導的缺血耐受狀態的標志物具有較高的臨床意義及科學價值。目前已有大量的研究確定了預適應反應的信號通路，其中一些因子已被選擇性用于生物標志物發展的臨床研究。理想的標志物不僅需要有較高的敏感性、特異性，易于獲得，還應該能夠體現出對刺激的早期反應，體現劑量-效應關系，與保護機制相聯系。尋找合適的生物標志物以精確衡量IPC反應方面仍有許多挑戰，識別內源性缺血耐受狀態可顯著促進血管疾病方面細胞保護領域的發展。然而考慮到這一現象的復雜性，未來尚需更多這類的臨床研究，以發現更多的標志物或標志物的組合。

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【點睛】

IPC是對抗缺血性腦血管病的細胞保護策略，確定適合的標志物以表明神經保護治療成功轉化具有重要的意義。