烏司他丁預(yù)先給藥、缺血預(yù)處理、缺血后處理聯(lián)合對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的影響

劉新結(jié) 夏開群

缺血性腎臟病是指超過管腔的60%腎動(dòng)脈重度狹窄或阻塞，腎臟嚴(yán)重缺血導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性腎臟病[1]。老年人腎動(dòng)脈狹窄主要由動(dòng)脈粥樣硬化病引起，故臨床上狹義“缺血性腎病”特指腎動(dòng)脈粥樣硬化所致缺血性腎臟病。腎缺血嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致腎缺血性高血壓，會(huì)給患者帶來極大的痛苦，因此在臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)腎缺血的研究較多。本研究針對(duì)大鼠腎缺血采用烏司他丁等進(jìn)行治療，并取得不錯(cuò)的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取40只健康雄性SD大鼠，大鼠的體質(zhì)量在250～300g之間，由某動(dòng)物研究中心提供，將所有的大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（n=20），確保40只大鼠均為雄性且沒有其它疾病，保證樣本的可研究性。

在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)使用的SOD和MDA測試盒，編號(hào)分別為A001和A003，由南京建成生物工程研究所提供的，需要準(zhǔn)備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)A045-2，準(zhǔn)備廣州天普升華醫(yī)藥股份有限公司的批號(hào)為02051102的醫(yī)用烏司他丁等實(shí)驗(yàn)需要用的實(shí)驗(yàn)器材和醫(yī)用試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將所有的大鼠注射3mL的10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，然后夾閉大鼠雙側(cè)的腎蒂，并且持續(xù)45min，然后再灌注腎臟I/R模型，持續(xù)6h，需要注意的是，夾腎蒂的要使用無損傷動(dòng)脈，當(dāng)腎臟的顏色變暗時(shí)腎臟的血流則被阻斷，通常情況下，45min之后松開動(dòng)脈夾，腎臟恢復(fù)到鮮紅血色表示腎臟血流恢復(fù)，在此過程中，需要注射2次20mL的林格液[2]。其中，對(duì)照組在持續(xù)45min的完全血流不流通之前，先夾閉大鼠雙側(cè)腎蒂保持5min的缺血狀態(tài)，再灌注5min，如此反復(fù)3次，再使得腎臟血流恢復(fù)。而實(shí)驗(yàn)組在缺血前30min從大鼠的尾巴靜脈注射烏司他丁，劑量為2×104μ/kg，剩余操作2組相同。

分別灌注6h后進(jìn)行開腹手術(shù)取出腎臟，將腎臟固定在濃度為10%的福爾馬林中，再制作石蠟切片準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，使用酶法測定血清肌配(Cr)含量、苦味酸不除蛋白法測定尿素氮含量和終點(diǎn)法測定尿酸(UA)的濃度；使用放射性分析法測定尿α1-MG和β2-MG的含量；硫代巴比妥酸法測定腎組織中丙二醛含量和黃嚓吟氧化酶法測定超氧化物歧化酶活性；采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腎組織Bcl-2mRNA以及Bax mRNA表示，然后計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)；采用免疫組化法觀察腎組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，計(jì)算蛋白陽性染色指數(shù)；蘇素-伊紅染色，在光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化[3]。

1.3 觀察指標(biāo) 按照已知的陽性標(biāo)本為標(biāo)準(zhǔn)，一抗作陰性對(duì)照使用生理鹽水，陽性染色細(xì)胞顯現(xiàn)棕黃色，使用光鏡找出病變嚴(yán)重部位觀察HE染色切片，1個(gè)視野觀察10個(gè)腎小管，共觀察100個(gè)腎小管，按照Paper法評(píng)分：如果腎小管出現(xiàn)明顯擴(kuò)張，并且細(xì)胞扁平，則評(píng)1分；腎小管出現(xiàn)管型則評(píng)2分；如果腎小管腔內(nèi)出現(xiàn)脫落的現(xiàn)象，并且出現(xiàn)壞死的細(xì)胞，最后出現(xiàn)成管型或細(xì)胞碎片的情況評(píng)1分；上皮細(xì)胞顆粒出現(xiàn)變性現(xiàn)象的評(píng)1分；空泡變性評(píng)1分，細(xì)胞核固縮評(píng)4分，心臟取血，離心，取血清，－20℃冰箱保存，測定尿素氮(BUN)和肌醉(Cr)濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件對(duì)本次研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)量資料以“x±s”記錄，并采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組處理大鼠腎臟缺血有一定改善，實(shí)驗(yàn)組改善較為顯著，使用烏司他丁聯(lián)合缺血前后處理，Cr和BUN濃度顯著升高，α1-MG和β2-MG含量顯著增加，因此對(duì)大鼠腎缺血使用烏司他丁、缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理效果更加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 2組大鼠處理前后各項(xiàng)指標(biāo)改善情況（±s）

表1 2組大鼠處理前后各項(xiàng)指標(biāo)改善情況（±s）

組別 時(shí)間 Cr（μmg/L）β2-MG（mg/L）對(duì)照組 處理前 51±4 4.7±1.0 7.2±3.3 7.6±3.4處理后 58±3 9.8±0.7 27.4±6.3 28.5±5.9實(shí)驗(yàn)組 處理前 52±3 4.8±0.9 7.3±3.2 7.5±3.3處理后 70±5 11.7±1.8 43.5±7.0 40.5±9.7 BUN(mol/L)α1-MG（mg/L）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，腎I/R損傷程度明顯，大鼠腎功能受損嚴(yán)重，但烏司他丁減輕了腎小管上皮細(xì)胞的變性和壞死，對(duì)大鼠腎I/R損傷起到了保護(hù)作用。

烏司他丁是一種廣譜蛋白酶抑制劑，臨床上主要用于治療急性胰腺炎及多種休克及手術(shù)侵襲所引起的并發(fā)癥，烏司他丁的保護(hù)機(jī)制與抗氧化作用、抑制氧自由基生成、清除氧自由基，從而增加腎小球和小管細(xì)胞的細(xì)胞膜及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器的膜穩(wěn)定性、減輕自由基引起的腎組織損傷與改善細(xì)胞能量代謝可能有關(guān)[4]。烏司他丁分子中具有多種酶的結(jié)合位點(diǎn)，能同時(shí)獨(dú)立抑制多種酶的活性，對(duì)缺血再灌注損傷中各種炎性介質(zhì)的釋放有明顯抑制作用，并具有穩(wěn)定溶酶體膜，抗氧化和清除氧自由基以及內(nèi)毒素的作用，改善微循環(huán)和組織灌注，還有利尿、抗休克作用。一系列的臨床和實(shí)驗(yàn)研究已表明，烏司他丁可抑制各種原因的腎損害[5]。

熱休克蛋白是生物在長期進(jìn)化過程中所保存下來的一組細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，當(dāng)受到相關(guān)刺激后就會(huì)增加，比如受熱、病原體和缺血缺氧等因素，會(huì)增加細(xì)胞的耐受力等在研究腎小管上皮細(xì)胞死亡的影響時(shí)，以缺氧對(duì)大鼠腎缺血損傷的情況為例，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白明顯增加，HSP 70在一定條件下能對(duì)腎臟缺血造成損傷。Bcl-2是哺乳細(xì)胞中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)與線蟲的抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因具有較高的同源性[6]。Bc1-2過量可引起細(xì)胞凋亡，Bcl-2蛋白在UR前后有一定變化，但在缺血前后沒有明顯差異。有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白可以降低自由基活性和抑制氧自由基生成發(fā)揮搞氧化作用，還能維持線料體的氧化功能。說明烏司他丁可能通過影響腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)增加膜穩(wěn)定性作用，但是還需要進(jìn)一步研究[7]。

綜上所述，烏司他丁對(duì)腎臟缺血損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)腎臟bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)，大鼠腎缺血使用烏司他丁、缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理效果更加顯著。部分復(fù)雜的腎臟手術(shù)中阻斷腎臟血流會(huì)引起腎缺血損傷[8]；在常溫下阻斷腎臟血流時(shí)間超過40min，會(huì)導(dǎo)致急性腎功能衰竭，移植腎早期功能對(duì)長期存活有重要的影響。

[1] 范玲玲,侯明星,都義日,等．烏司他丁對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠血清SOD活性及MDA水平的影響[J]．山東醫(yī)藥,2014,32(10)：39-40．

[2] 錢小英,金曉盛,邵美琴,等．烏司他丁聯(lián)合維拉帕米在大鼠急性肺缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用[J]．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2014,31(5)：1054-1056．

[3] 李廣罡,鄭濤．烏司他丁對(duì)大鼠缺血-再灌注肝臟Toll樣受體表達(dá)的影響[J]．中國急救醫(yī)學(xué),2013,33(6)：554-556．

[4] 段志學(xué)．烏司他丁加甲基潑尼松龍對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎血清淀粉酶及細(xì)胞因子的影響[J]．當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010,16（12）：30-31．

[5] 邵壯,熊江,郭偉,等．烏司他丁對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J]．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(10)：777-781．

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[7] 駱喜寶,潘云,陳燕,等．烏司他丁對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠凝血功能及血小板的影響[J]．廣東醫(yī)學(xué),2013,34(1)：40-42．

[8] 谷力加,黃邵洪,吳一龍,等．烏司他丁對(duì)兔在體肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2002,10(6)：106-107．