早期高壓氧對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦神經(jīng)保護的效果探討

姜濤， 鮑靖， 張麗華， 鮑秀芹

實驗論著

早期高壓氧對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦神經(jīng)保護的效果探討

姜濤， 鮑靖， 張麗華， 鮑秀芹

目的 探討早期高壓氧對缺血缺氧性腦損傷(HIBD)新生大鼠腦神經(jīng)保護的效果。方法 將7日齡新生Wistar大鼠120只隨機分為假手術組、HIBD組、高壓氧組，每組各40只。將高壓氧組再隨機分為早期高壓氧亞組和晚期高壓氧亞組，每亞組各20只。對所有大鼠建立HIBD模型后(假手術組采用假手術處理)，早期高壓氧亞組在建模后1 h內，晚期高壓氧亞組在建模后48 h實行高壓氧治療(2 ATA，每次90 min，24 h 1次，連續(xù)治療7 d)。各亞組治療結束后處死大鼠，假手術組與HIBD組處死等量大鼠。利用免疫組織化學法對大鼠海馬中神經(jīng)巢蛋白(Nestin)的含量進行檢測，利用Morris水迷宮實驗對大鼠學習記憶功能進行檢測。結果 假手術組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量為(10.26±1.37)個/HP，早期高壓氧亞組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量為(15.82±2.19)個/HP，晚期高壓氧亞組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量為(32.64±4.83)個/HP，HIBD組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量為(36.18±4.02)個/HP。高壓氧組和HIBD組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量顯著高于假手術組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，晚期高壓氧亞組顯著高于早期高壓氧亞組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，晚期高壓氧亞組與HIBD組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；4組平均逃逸潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(F=24.18，P<0.05)，假手術組<早期高壓氧組<晚期高壓氧組早期高壓氧組>晚期高壓氧組，而晚期高壓氧組和HIBD組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組搜索速度組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 早期高壓氧對HIBD腦損傷具有保護功能，Nestin蛋白可能參與了腦神經(jīng)的修復過程，早期高壓氧還對HIBD引起的遠期學習記憶功能障礙有改善作用。

缺血缺氧性腦??； 高壓氧； 腦神經(jīng)； 大鼠，Wistar； 動物，實驗

新生兒缺血缺氧性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)是指在圍生期缺氧導致的腦缺血缺氧性損害。高壓氧技術在最近幾年廣泛被用于治療HIBD，被認為是目前比較有效的治療方法。國外有報道稱高壓氧可以在短時間內提高血液中的氧分壓，改善大腦缺氧狀態(tài)，可以有效、迅速糾正腦缺血缺氧狀態(tài)[1]。但目前高壓氧對HIBD的作用機制尚未明了，本次研究擬通過建立大鼠HIBD模型，探討早期高壓氧對HIBD新生大鼠腦神經(jīng)保護的效果，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 7日齡清潔級Wistar大鼠120只，雄性51只，雌性69只，體質量11～13 g，由佳木斯大學動物實驗室提供(生產許可證：SCXK(吉)-2011-0004)。按隨機數(shù)字表法將120只大鼠分為假手術組、HIBD組、高壓氧組，每組各40只。將高壓氧組按隨機數(shù)字表法分為早期高壓氧亞組和晚期高壓氧亞組，每亞組各20只。

1.2 HIBD模型建立方法 采用經(jīng)典Rice法制作HIBD模型[2]。將大鼠用乙醚麻醉，仰臥位固定，備皮，消毒頸部周圍皮膚，沿正中線作頸部切口，找到并游離左側頸總動脈，近心端結扎后剪斷。整個過程控制在10 min內。術后2 h將大鼠放入37 ℃恒溫密閉箱內，向箱內持續(xù)通氮氧混合氣體，控制箱內氧濃度為70 mL/L，2 h后將大鼠取出，由母鼠喂養(yǎng)。假手術組大鼠只游離左側頸總動脈后縫合。

1.3 高壓氧操作方法 早期高壓氧亞組大鼠在建模后1 h，晚期高壓氧亞組大鼠在建模后48 h放入氧體積分數(shù)900～1 000 mL/L，壓力為2 ATA的氧倉內吸氧90 min，每間隔24 h進行治療1次，連續(xù)治療7次。每日記錄大鼠生存情況。

1.4 神經(jīng)巢(Nestin)蛋白和Morris水迷宮測定方法 在實驗結束的時間點，將各亞組大鼠取10只檢測Nestin蛋白，另外10只進行Morris水迷宮實驗。

用于檢測Nestin蛋白的大鼠處死后，開胸，暴露心臟，行主動脈插管，用10 ℃生理鹽水充分沖洗血液。開顱取腦后，迅速放入-35 ℃恒冷箱切片機中保存，2～3 h后沿視交叉做厚10 μm的冠狀冰凍切片，經(jīng)多聚賴氨酸處理后，放入20 ℃恒溫箱中干燥[3]。用免疫組織化學SABC法對切片進行染色，單抗選擇1∶100小鼠抗大鼠的Nestin單克隆抗體，DAB染色，Nestin蛋白在胞質內呈棕色或棕褐色為陽性。每個標本觀察3張切片，每張切片在400倍鏡下選取4個視野計數(shù)陽性細胞，計算平均值。

本次實驗用直徑為120 cm的Morris水迷宮，并均分為4個象限，在其中1個象限內放置一個略高出水面的平臺，將該象限設置為平臺象限。實驗前24 h將大鼠放入迷宮，自由游泳3 min。測試內容：(1)定位航行。每天上午9時將每只大鼠從4個象限入水點放入迷宮，記錄從大鼠進入迷宮到四肢完全爬上平臺所耗時間，即逃逸潛伏期，連續(xù)測試4 d。(2)空間探索。第5日將平臺撤走，將大鼠放入迷宮后，記錄120 s內大鼠的行動軌跡、對原平臺的搜索耗時和搜索距離，計算搜索速度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件對所有實驗所得數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Nestin蛋白檢出情況 見表1。

表1結果表明，4組大鼠Nestin蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，進一步進行兩兩比較，高壓氧組和HIBD組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；晚期高壓氧亞組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量顯著高于早期高壓氧亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；晚期高壓氧亞組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量與HIBD組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮測試結果 見表2，3。

表2結果表明，4組大鼠平均潛伏期比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步進行兩兩比較，各組大鼠的組內平均逃逸潛伏期每天均顯著較前一天縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。前三天，4組平均逃逸潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(F=24.18，P<0.05)，假手術組<早期高壓氧組<晚期高壓氧組0.05)。

表3結果表明，4組大鼠空間探索各項指標比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步進行兩兩比較，假手術組、早期高壓氧組和晚期高壓氧組3組大鼠在搜索耗時和搜索路程上組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=21.05，P<0.05)，均為假手術組>早期高壓氧組>晚期高壓氧組，而晚期高壓氧組與HIBD組在搜索耗時和搜索路程上比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組搜索速度組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

高壓氧作為目前一種比較有效的治療方法用于治療新生兒疾病，特別是缺血缺氧性腦病已有多年歷史，但由于缺乏科學的理論依據(jù)和對毒副反應的誤解，在臨床應用中有爭議[4]。目前多數(shù)動物研究認為高壓氧對新生兒缺氧缺血性腦病治療有效，可減輕神經(jīng)元損傷，促進遠期功能的恢復。Nestin蛋白是一種中間絲蛋白，主要分布在神經(jīng)上皮干細胞的細胞質中，是細胞骨架的重要構成部分。Hei等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)Nestin蛋白在神經(jīng)上皮干細胞開始遷移時，其陽性表達開始增加，遷移過程完成后，其含量逐漸下降，當神經(jīng)細胞分化成熟后停止表達，故Nestin蛋白一直被認為是神經(jīng)上皮干細胞的標志蛋白。楊榮等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)，在大鼠建立缺血缺氧模型后，其腦內缺血缺氧區(qū)域，以及周圍部分區(qū)域的Nestin蛋白陽性表達顯著上升。本研究結果發(fā)現(xiàn)高壓氧組和HIBD組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量顯著高于假手術組(P<0.05)，晚期高壓氧亞組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量顯著高于早期高壓氧亞組(P<0.05)，而晚期高壓氧亞組Nestin陽性細胞檢出數(shù)量略低于HIBD組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這說明HIBD后腦部神經(jīng)細胞迅速再生以代償因缺血缺氧而壞死的細胞，而早期高壓氧組大鼠腦組織內Nestin蛋白雖然較假手術組表達顯著升高(P<0.05)，但顯著低于晚期高壓氧組(P<0.05)，這說明早期應用高壓氧對HIBD效果顯著。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，高壓氧療法可以迅速提高腦內組織的含氧量以及氧儲備量，對糾正腦組織缺血缺氧狀態(tài)迅速、有效，且可以降低腦細胞因缺血缺氧而發(fā)生的壞死。而Zhang等[8]研究結果顯示，高壓氧不僅可以有效降低無氧酵解過程，糾正酸中毒狀態(tài)，還對腦血管有收縮作用，從而減少腦血流量，達到降低腦水腫的目的。而對于高壓氧對HIBD的治療機制，石瑞成等[9]認為是由于高壓氧狀態(tài)可以增加腦內超氧化物歧化酶的含量，對缺氧產生的自由基迅速清除，提高抗氧化能力，從而可以減輕再灌注后引起的缺血-再灌注損傷過程。本次研究結果也證實了石瑞成的觀點。本次研究結果證明，早期應用高壓氧，對神經(jīng)細胞可以起到更好的保護作用，這可能是因為在長時間缺血缺氧后，神經(jīng)細胞發(fā)生了不可逆的壞死，需要神經(jīng)干細胞大量增生、代償，而這個過程十分緩慢，晚期高壓氧組中Nestin蛋白的大量表達也間接證實了這一點。

Morris水迷宮是測試大鼠學習、記憶功能的有效方法，可以間接反應海馬區(qū)的功能[10]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，4組平均逃逸潛伏期為假手術組<早期高壓氧組<晚期高壓氧組0.05)，這可能是因為此次的HIBD建模還不能對大鼠的遠期運動功能產生影響，而早期高壓氧和晚期高壓氧兩組在搜索速度上差異無統(tǒng)計學意義，說明延遲高壓氧治療無法對遠期的腦運動功能起到保護作用，而其機制有待進一步研究。

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(本文編輯：劉穎)

Study on the effect of early hyperbaric oxygen in protecting brain nerves of neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage

JIANGTao,BAOJing，ZHANGLihua，BAOXiuqin.

JiamusiUniversityThirdAffiliatedHospital，Jiamusi154002，China.

Objective To investigate the effect of early hyperbaric oxygen(HBO) in protecting brain nerves of neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage(HIBD).Methods A total of 120 7-day old neonatal Wistar rats were randomly divided into sham operation group(control group), hypoxic ischemic brain injury group(group HIBD) and hyperbaric oxygen group(HBO group), with 40 rats in each group. The HBO group was randomly divided into early hyperbaric oxygen subgroups(EHBO subgroup) and late hyperbaric oxygen subgroups(LHBO subgroup),with 20 rats in each group. After establishing the HIBD model for all rats(control group with sham operation),hyperbaric oxygen treatment was performed in EHBO subgroup after 1 h, and in LHBO subgroup after 48 h(2 ATA, every 90 minutes, 24 hours once, continuous treatment of 7 day).After treatment, the rats in subgroups were killed, and the same number of rats in the control group and HIBD group were also killed. Hippocampus Nestin in the nerve of rat was determined using immunohistochemical method, and learning and memory function in rats were tested using the Morris water maze test. Results In the control group Nestin positive cell detection rate was (10.26±1.37)/HP, in EHBO subgroup it was (15.82±2.19)/HP, LHBO subgroup (32.64±4.83)/HP, HIBD group (36.18±4.02)/HP. The detection rate of Nestin positive cells in the HBO group, and HIBD group was significantly higher than that of the control group(P<0.05), and in the LHBO subgroup it was significantly higher compared with that of the EHBO subgroups(P<0.05), while the LHBO subgroup and HIBD group had no significant difference(P>0.05); the four groups had significant differences in average EL (F=24.18,P<0.05)；the rats in control group，EHBO and LHBO group had significant difference in the search time and search distance(F=21.05,P<0.05), but there was no significant difference between LHBO and HIBD groups and among the groups in search time(P>0.05). Conclusion Early BHO has protective effect on brain injury；Nestin protein may be involved in the repair of brain nerves；early HBO can improve the future learning and memory function which is impaired by HIBD.

hypoxic ischemic brain damage; hyperbaric oxygen; cranial nerve; Wistar rat; animal,experiment

黑龍江省教育廳科學技術項目資助(12511537)；佳木斯大學科學技術重點項目資助(sz2014-002)

154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學附屬第三醫(yī)院腦癱三科

姜濤(1984-)，男，醫(yī)師，2012級佳木斯大學康復醫(yī)學院碩士研究生在讀。研究方向：腦損傷的發(fā)病機制及其早期防治研究。

張麗華，154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學附屬第三醫(yī)院腦癱三科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.03.007

R-33

A

1674-3865(2015)03-0215-04

2015-04-10)