人附睪RNase10基因在大腸桿菌中的表達(dá)

摘要：以人附睪cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RNase10基因，構(gòu)建pET32b（+）-RNase10體外表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)RNase10基因的表達(dá)，采用SDS-PAGE法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示融合蛋白分子量為24 ku，與預(yù)期相符，表明人附睪RNase10基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。

關(guān)鍵詞：人附睪RNase10基因；大腸桿菌（Escherichia coli）；表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）17-4245-03

Expression of Human Epididymis RNase10 Gene in Escherichia coli

LIU Xiao-ling，LIU Xue，WANG Min-qiang，WEI Hai-tao

（College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China）

Abstract： Using human epididymis cDNA as template， RNase10 gene was amplified and recombined into prokaryotic expression vector pET32b（+）， which was constructed and transformed into Escherichia coli DH5α. Plasmids were extracted from positive clones， and transformed into BL21（DE3）. Furthermore， the protein expression of RNase10 was induced by IPTG. A band about 24 ku was detected by SDS-PAGE， showing that RNase10 of human epididymis was expressed successfully in cell of E. coli DH5α.

Key words： RNase10 gene of human epididymis； Escherichia coli； expression

收稿日期：2012-11-05

基金項(xiàng)目：煙臺(tái)大學(xué)青年基金項(xiàng)目（SM11Z7）

作者簡(jiǎn)介：劉曉玲（1976-），女，山東萊州人，講師，博士，主要從事分子生物研究，（電話）0535-6902638（電子信箱）lxl2008i@163.com。

RNase A超家族（Ribonuclease A superfamily）是結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，研究表明RNase A超家族的成員參與消化、血管生成及先天性免疫等多種生物過(guò)程[1]。RNase10（Ribonuclease 10）基因主要表達(dá)在附睪的頭部，基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明RNase10與男性生殖功能相關(guān)[2]，進(jìn)一步推測(cè)該基因在受精過(guò)程中具有重要意義[3]。本研究克隆人附睪RNase10基因，構(gòu)建了大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)載體并獲得蛋白，為進(jìn)一步闡明RNase10基因在精子相關(guān)生理過(guò)程中的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)研究男性不育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3），載體pET32b（+），T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及其他工具酶，IPTG，X-gal等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，其他試劑為分析純，人附睪cDNA模板由煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院惠贈(zèng)。

DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及搖床（北京市六一儀器廠）；5810R型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；電熱恒溫水浴鍋（山東龍口市先科儀器公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；TC-XP型基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人RNase10基因序列（序列號(hào)：NM_001012975）設(shè)計(jì)引物，對(duì)其信號(hào)肽切割位點(diǎn)和pET32b（+）載體多克隆位點(diǎn)進(jìn)行分析，在去除了信號(hào)肽的RNase10基因DNA序列兩端分別加上KpnⅠ及EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，另外在上游引物處添加腸激酶位點(diǎn)以便在融合表達(dá)后獲取目的蛋白序列[4]，引物序列為P1，5′-TTGGTACCGACGACGACGACAAGCTTCA

TATGGCTACAGCAG-3′；P2，5′-GGCGAATTCTCAT

TGTCCAGTTGGTAACTGGCGCTTC-3′（下劃直線部分分別為KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，曲線部分為腸激酶位點(diǎn)），目標(biāo)片段長(zhǎng)度為611 bp。

1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增及純化 PCR反應(yīng)體系包括2 μL 10×PCR Buffer （含Mg2+ 25 mmol/L），1.6 μL dNTP （2.5 mmol/L），上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），0.5 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），1 μL cDNA模板，加滅菌水至總反應(yīng)體積為20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.2.3 目的基因與載體的連接 分別對(duì)pET32b（+）質(zhì)粒載體和目的基因進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并利用膠回收試劑盒回收純化后將載體與目的基因連接，連接反應(yīng)體系為10 μL，包含5 μL酶切后的載體、3 μL目的DNA片段、1 μL 10×DNA連接緩沖液、1 μL T4 DNA連接酶，16 ℃連接過(guò)夜。

1.2.4 克隆測(cè)序 利用CaCl2轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用抗性篩選及菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果，陽(yáng)性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè) 將測(cè)序結(jié)果與RNase 10基因序列一致的陽(yáng)性克隆大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21（DE3）中，篩選的陽(yáng)性克隆于37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)0.6左右，取1 mL培養(yǎng)物12 000 r/min離心1 min，收集細(xì)胞沉淀，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別誘導(dǎo)表達(dá)0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h后離心收集菌體，沉淀中加SDS-PAGE變性上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min后采用14%的不連續(xù)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 人附睪RNase10基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用設(shè)計(jì)的引物對(duì)人附睪RNase10基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，產(chǎn)物大小約為610 bp，與預(yù)期相符，表明人附睪RNase10基因擴(kuò)增成功。

2.2 酶切及重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

擴(kuò)增得到的人附睪RNase10基因及質(zhì)粒載體分別進(jìn)行KpnⅠ及EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收后采用T4 DNA連接酶連接，形成長(zhǎng)約6 400 bp的重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2。與酶切后載體相比，重組質(zhì)粒的條帶長(zhǎng)度大于質(zhì)粒空載體，說(shuō)明重組成功。

2.3 測(cè)序結(jié)果

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α中培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示重組表達(dá)載體中的目的基因完整且未發(fā)生變異[5]。

2.4 融合蛋白在BL21（DE3）中的表達(dá)

對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，添加1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，收集各時(shí)間段的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可知，人附睪RNase10基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)分子量大小約為24 ku，采用Dnastar軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中人附睪RNase10基因的序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)去除信號(hào)肽后該蛋白的大小約為21 ku，而組氨酸標(biāo)簽的分子量約為3 ku[6]，可見(jiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)分子量與預(yù)測(cè)的RNase10分子量大小相符。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，融合蛋白的SDS-PAGE條帶寬度和亮度都增加，可見(jiàn)融合蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

3 小結(jié)與討論

RNase A超家族是脊椎動(dòng)物特異性酶家族，該家族成員參與脊椎動(dòng)物的多種生命活動(dòng)[2]。前期研究表明，RNase10基因主要在人附睪的頭部表達(dá)。而附睪除能貯存精子外還能分泌有助于精子成熟的附睪液，故附睪與精子成熟、運(yùn)動(dòng)、獲能以及受精等多種生理功能密切相關(guān)[7]。RNase10基因作為附睪特異表達(dá)的基因，對(duì)于男性生殖有一定的作用，通過(guò)體外蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，可以為進(jìn)一步研究該基因在男性生殖生理過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)，對(duì)研究男性不育具有重要意義。

本研究構(gòu)建了人附睪RNase10基因的體外表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了大小約為24 ku的融合蛋白。電泳結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)獲得的融合蛋白條帶清晰明亮，表明得到的人附睪RNase10基因表達(dá)產(chǎn)物純度和表達(dá)量均較高，為后期蛋白質(zhì)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 向 闈）