生長相關蛋白-43影響神經細胞分裂方向作用的研究

黃蕊，文玉軍，鞠莉莉

卒中嚴重威脅人類健康，高發病率、高病死率、高致殘率給全球帶來沉重的疾病負擔[1]。國外研究者在應用運動皮層電刺激的方法治療卒中后慢性神經疼痛的過程中，發現患者在治療后，同時伴有的肢體運動功能障礙有了明顯的恢復[2]。現研究表明，應用皮層電刺激聯合功能鍛煉的大鼠腦梗死灶周圍皮層運動區的生長相關蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）明顯多于單純功能鍛煉組，這與突觸可塑性相關[3-4]。GAP-43是神經組織特異性表達的蛋白，與神經發育、軸突再生、突觸重建密切相關，被認為是神經發育和再生的內在決定因子[5-8]。在哺乳動物的前腦中，水平分裂的神經祖細胞中高表達GAP-43[9]；它與中心體相關且為中心體定位所必需[10]。由此可知，GAP-43可能是一種與細胞極性和細胞分裂相關的細胞命運決定子。然而，人們至今還不清楚GAP-43在細胞極性和細胞分裂方式調控的過程中究竟行使什么功能。為了闡明這個問題，我們對GAP-43是通過何種方式參與神經細胞分裂方向調控的進行探討，希望以此對GAP-43在神經發育及卒中等神經損傷修復突觸重建中的作用有新的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物SPF級C57BL/6J GAP-43高表達轉基因孕鼠6只，野生型C57BL/6J孕鼠6只，中國醫學科學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK（京）2009-0007。所有實驗用小鼠均在SPF級動物房飼養和繁殖。溫度控制在22℃，濕度70%，自動光控（12 h明/12 h暗），自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑 十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯單月桂酸酯、丙烯酰胺、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺以及兔抗小鼠actin抗體、羊抗小鼠GAP-43抗體均購自Sigma公司，山羊抗兔Gαi抗體購自Santa公司；過硫酸氨、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺為Gibco公司產品，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG為北京中山生物技術有限公司產品，BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，Kodak BioMax MR X-光片來自Kodak公司，封閉用正常山羊血清購自武漢博士德生物技術有限公司，Alexa flour 488/594標記的山羊抗小鼠/抗兔IgG熒光二抗和TritonX-100則分別購自Moleculor Probe公司和Sigma公司。免疫共沉淀試劑盒（Immunoprecipitation Kit）與G蛋白珠子（Protein-G-agarose）均購自瑞士Roche公司。其他常用試劑均屬于國產或進口的分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫熒光技術定性明確GAP-43的表達位置 分別取E13.5 d GAP-43轉基因陽性胎鼠和對照野生型胎鼠各3只，冷凍切片機腦室區（ventricular zone，VZ）免疫熒光染色連續切片，切片厚度為40 ?m，全部貼片。切片入0.01 mol/L磷酸緩沖液和吐溫-20（phosphate buffer solution and Tween-20，PBST）中浸洗3次（每次5 min）后，入5%正常血清及0.1%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）混合封閉液中室溫封閉抗原；傾去血清后直接置入用0.01 mol/L PBST按1∶1000稀釋的GAP-43的抗體和用0.01 mol/L PBST按1∶500稀釋的Gαi的抗體中，4℃過夜；切片再入PBST中浸洗3次（每次5 min），后放入用0.01 mol/L PBST稀釋好的熒光二抗（1∶500稀釋）中，室溫1 h；0.01 mol/L PBS浸洗3次（每次5 min）后，用1∶3000的Hochest33258染核，15 min，室溫避光；將切片最后用PBS浸洗2次（每次5 min），70%甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察照相。

1.2.2 Western blot技術檢測定量明確GAP-43的表達位置及表達量 4℃條件下，在E13.5 d12只實驗組及對照組鼠腦中加入裂解液分別提取膜蛋白和細胞質蛋白，用BCA Protein Assay Kit測定GAP-43樣品蛋白含量。每個樣本取10 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用Tris-HCl緩沖鹽溶液和吐溫-20（tris buffered saline and Tween-20，TBST）稀釋的羊抗小鼠源重組的GAP-43單克隆抗體（1∶3000稀釋），4℃搖床雜交過夜；待恢復室溫后，TBST洗3次，每次10 min置入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體（1∶5000稀釋）室溫雜交1 h，洗3次，每次10 min，將膜置于化學發光液中，X線膠片曝光，顯影及定影。

1.2.3 免疫共沉淀技術檢測GAP-43與Gαi間的相互作用 4℃條件下，在E17.5 d9只實驗組及對照組鼠腦中加入裂解液分別提取蛋白，將提取到的蛋白分為3組（實驗組、陽性對照組和陰性對照組），4℃離心，12 000×g，45 min；取上清，各加入Protein-G-agarose 25 μl，4℃搖床3 h；4℃離心，12 000×g，5 min；取上清，各加入10 μl兔源Gαi抗體（1∶50稀釋），4℃搖床過夜；4℃離心，12 000×g，5 min，去上清后，加入500 μl 洗脫緩沖液1，4℃搖床，20 min，重復1次；4℃離心，12 000×g，5 min，去上清后，加入500 μl 洗脫緩沖液2，4℃搖床，20 min，重復1次；4℃離心，12 000×g，5 min，去上清后，加入500 μl 洗脫緩沖液3，4℃搖床，20 min；4℃離心，12 000×g，5 min，去上清后加入5×蛋白上樣緩沖液（1∶4稀釋）；95℃加熱3 min；4℃離心，12 000×g，5 min，取上清。每個樣本取10 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用TBST稀釋的羊抗小鼠源重組的GAP-43單克隆抗體（1∶3000稀釋），4℃搖床雜交過夜；待恢復室溫后，TBST洗3次，每次10 min置入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體（1∶5000稀釋）室溫雜交1 h，洗3次，每次10 min，將膜置于化學發光液中，X線膠片曝光，顯影及定影。

1.2.4 細胞分裂的計數 分別取E13.5 d和E17.5 d的9只實驗組及對照組胎鼠VZ區腦切片計數轉基因胚胎鼠腦中神經前體細胞中沿水平和垂直不同方向分裂的細胞數量。根據細胞分裂平面與VZ面的夾角不同分為3種分裂方式：平行（0°～30°）、中間（30°～60°）、垂直（60°～90°）分裂。沿胚胎鼠腦的VZ面畫一條長直線，沿細胞的分裂平面畫一條直線，測量兩條直線間的夾角，即為神經前體細胞分裂平面與腦室面的夾角。統計分析VZ區各種分裂角度的細胞數量，E13.5 d轉基因組和野生型組的分裂細胞數量為168例；E17.5 d轉基因組和野生型組的分裂細胞數量為105例。

1.2.5 統計學分析 采用SPSS 13.0對數據進行統計分析，計量資料經檢驗后符合正態分布，用“均數±標準差”表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。轉基因組和野生型組細胞分裂方向比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 GAP-43表達在細胞膜上 E13.5 d高表達GAP-43轉基因陽性胎鼠和對照野生型胎鼠腦區免疫熒光染色切片，可見GAP-43陽性反應。蛋白免疫印跡檢測E13.5 d GAP-43表達的結果顯示，GAP-43高表達轉基因組的小鼠其GAP-43蛋白的表達量高于對照組的小鼠（P＜0.05）（圖1），且GAP-43特異性表達于細胞膜上（圖2）。

2.2 GAP-43和Gαi間存在相互作用 取E17.5 d高表達GAP-43轉基因陽性胎鼠腦組織，經冷凍切片后免疫熒光共染色，共聚焦顯微鏡觀察單層胎鼠腦區免疫熒光染色切片，結果顯示GAP-43與Gαi存在免疫熒光共定位（圖3D中箭頭所示）。為了進一步證明GAP-43與Gαi間是否存在相互作用，取E17.5 d高表達GAP-43轉基因陽性胎鼠腦組織進行co-IP作用，結果顯示GAP-43和Gαi相互結合（圖3E中箭頭所示）。

2.3 GAP-43高表達影響細胞的分裂平面 測量E13.5 d及E17.5 d轉基因組和野生型組神經前體細胞分裂平面與VZ面的夾角（圖4）。統計分析VZ區各種分裂角度的細胞數量。E13.5 d時，轉基因組與對照組相比，細胞沿水平、中間和垂直角度分裂的細胞數量差異有顯著性（P＜0.05）（表1）；而E17.5 d時，轉基因組與對照組相比，以不同角度（水平、中間、垂直）分裂的細胞數量差異無顯著性（P＞0.05）（表2）。

圖1 轉基因組和野生型組GAP-43表達量比較（Volume=像素信號強度總和INT×像素面積mm2）注：GAP-43：生長相關蛋白－43

圖2 GAP-43表達的檢測注：Western blot結果顯示GAP-43表達位置在細胞膜上；其中β-actin作為GAP-43的陽性對照；GAP-43：生長相關蛋白-43

圖3 檢測GAP-43和Gαi間的作用注：圖A～D為E17.5 d鼠腦免疫熒光染色切片，共聚焦顯微鏡下觀察照相，其中綠色為GAP-43；紅色為Gαi；藍色為細胞核；黃色為GAP-43和G蛋白免疫熒光共定位，標尺為250 μm。圖E示在胎鼠腦蛋白提取液中加入Gαi的一抗與G蛋白，其中Gαi的一抗與G蛋白連接，然后用Western blot的方法檢測與Gαi相互作用的GAP-43。在蛋白提取液中加入IgG的一抗與G蛋白，其中IgG的一抗與G蛋白連接作為陰性對照。胎鼠腦蛋白提取液行免疫印跡作為陽性對照。IB：免疫印跡，IP：免疫沉淀；GAP-43：生長相關蛋白-43

圖4 GAP-43高表達影響神經細胞分裂方向注：圖A～H為E13.5 d轉基因組和野生型組鼠腦免疫熒光染色切片，共聚焦顯微鏡下觀察照相，圖中綠色為GAP-43；藍色為細胞核。圖A為胚胎E13.5 d胎鼠全腦染色，標尺為250 μm。圖B～E為轉基因組，沿腦室區畫一條黃色長線，在表達GAP-43的細胞中黃色短線代表細胞分裂平面（細胞分裂后期），白色箭頭所示為水平分裂的細胞（細胞分裂平面與腦室區的夾角為25°）；圖E為圖D中箭頭所示分裂細胞3倍放大圖。圖F～H為對照組，沿腦室區畫一條黃色長線，黃色短線代表細胞分裂平面（細胞分裂后期）；白色箭頭所示為豎直分裂的細胞（細胞分裂平面與腦室區的夾角為73°），標尺為50 μm。GAP-43：生長相關蛋白-43

表1 胚胎E13.5 d轉基因組與野生型組細胞分裂方向比較

3 討論

GAP-43是神經發育和再生的內在決定因子[5-8]，通過電鏡對大鼠腦梗死灶周圍皮層突觸的超微結構進行觀察，發現GAP-43參與了腦梗死灶周圍皮層的突觸重建[3-4]。目前研究發現GAP-43不僅存在于已分化定型、有軸突生長的神經元中，而且在NPC中就有表達[11-12]，參與神經發生過程。且體內研究顯示GAP-43與細胞中心體共定位且與中心體定位有關[6]，提示GAP-43可能是一種與細胞極性相關的細胞命運決定子。

為了進一步揭示GAP-43參與神經發育的機制，本課題組前期建立了GAP-43高表達的轉基因小鼠[13]。通過免疫熒光法和蛋白免疫印跡法測定GAP-43在實驗組和對照組細胞內的定位，因為GAP-43是膜相關蛋白，其表達位置是在細胞膜上[14]，結果表明轉基因組中GAP-43的表達位置并沒有改變（圖2）；而且轉基因組的GAP-43蛋白表達量高于野生型組（圖1）。Gαi可以和Gβγ組成G蛋白復合體，Gβγ蛋白可以調控紡錘體的旋轉，使細胞發生不對稱的分裂[15]，而GAP-43又與G蛋白有密切關系，即G蛋白與其受體反應位點與GAP-43有交叉性[16]。以往的研究表明GAP-43不僅可以聚集細胞骨架肌動蛋白[17]，而且可以招募包括G蛋白家族在內的信號蛋白[18-21]。我們前期的結果已經證明了GAP-43與細胞中心體不存在共定位[22]，本研究表明，GAP-43與Gαi共定位（圖3）。G0蛋白可以通過作用于GAP-43抑制GAP-43的活性[19]，我們免疫共沉淀的結果進一步明確了GAP-43與Gαi間存在作用（圖3箭頭所示），這與以上的研究結果一致。

表2 胚胎E17.5 d轉基因組與野生型組細胞分裂方向比較

近期研究表明，在哺乳動物的前腦中，GAP-43在水平分裂的神經祖細胞中有高表達，并與水平分裂的細胞密切相關[11]。細胞分裂平面與VZ面的夾角不同產生的分裂方式也不同：當夾角是垂直時，發生對稱分裂，可以形成兩個相同的子代；當夾角是平行時，發生不對稱分裂，可以產生兩個不同的子代[23]。為了進一步揭示GAP-43在細胞分裂方向中的作用機制，本課題組對轉基因組胚胎鼠腦內神經前體細胞沿水平、中間角度和垂直方向分裂的細胞進行計數，并與對照組胎腦進行對照。結果顯示E13.5 d時轉基因組與對照組相比，細胞沿水平、中間和垂直角度分裂的細胞數量差異有顯著性（表1）。抑制GAP-43表達可以改變神經前體細胞分化[11-12]，根據神經發生的分裂平面理論[23]，GAP-43參與神經前體細胞分化的機制可能是參與調控細胞分裂平面[11-12]，并且G蛋白可以調控紡錘體的旋轉使細胞發生不對稱分裂[15]，所以說GAP-43參與神經發生的機制很可能是通過G蛋白改變神經前體細胞的分裂方向來實現的，這與前人的研究成果一致。但是，本研究對于GAP-43與G蛋白作用的分子機制了解非常有限，接下來可以通過對Gαi的N端氨基酸作用位點的點突變及使用相應的蛋白抑制劑來進一步明確二者間作用對紡錘體旋轉的影響。另外，GAP-43高表達改變了NPC的分裂方向，這勢必會引起分化成神經元的數量改變[24]，GAP-43對于神經元數量改變的影響本研究并未涉及有待于進一步的研究。

對于GAP-43通過G蛋白參與細胞分裂平面調控這一問題的探討，對進一步探索NPC分化的分子機制有重要意義，有助于對GAP-43在神經發育及卒中等神經損傷修復突觸重建中的作用有新的認識。

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【點睛】

在GAP-43高表達的轉基因小鼠中，發現GAP-43與G蛋白相互作用，并可以改變細胞分裂平面。

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