超聲靶向微泡破裂技術聯合shRNA質粒沉默Toll樣受體4基因

鄭翾，梁燕玲，陳佳，陳智毅，李斯穎，羅建華，方小波

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）負責啟動胞內一系列細胞因子的轉錄反應，引起促炎癥因子的生成和釋放，促使免疫炎癥反應的發生，以清除病原微生物；其中TLR4是該家族中有代表性的一員，能特征性地識別革蘭陰性菌壁中的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（外源性配體）及識別機體的各種危險信號（內源性配體）從而導致機體產生炎癥和免疫反應。既往的研究證明TLR4通路參與了腦缺血后的神經損傷機制[1-2]。而本課題組前期的研究發現TLR4與高血糖合并腦缺血后的癇性發作相關[3]，而TLR4拮抗劑可明顯減少急性癲癇模型的癇性發作頻率、縮短發作持續時間，推遲首次發作的發生[4]。因此，如果能找出一種安全低價高效的方法抑制TLR4的表達，則有可能減輕患者腦缺血后的神經損傷，也有可能降低高血糖合并腦缺血后的癇性發作。

核糖核酸干擾（RNA interference，RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈核糖核酸（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象[5]。其高度的特異性及抑制性能有效降解目的基因的信使RNA（messenger deoxyribonucleic acid,mRNA），該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。在該技術中，短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）有著良好的抑制效果及持續時間。傳統的基因載體使用的病毒載體因其免疫原性及對操作者的潛在危害限制了它的臨床應用，而超聲靶向微泡破裂（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）具有安全性、靶向性、促藥物滲透或轉移的特點[6]，可攜帶基因或藥物到達靶組織，成為近年來藥物載體的研究熱點。本實驗觀察UTMD聯合shRNA的方法沉默腦中TLR4的可行性，促進對非侵襲性的基因傳輸的了解。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 根據文獻[5]，選擇TLR4-439起始點為靶序列（靶序列如下：TTAAGAAGCTATAGCTTCACC。設計shDNA模板序列為5’-CACCGTTAAGCTATAGCTTCACCTTCAAGAGAGGT GAAGCTATAGCTTCTTAATTTTTTG-3’，3’-CAATTC TTCGATATCGAAGTGGAAGGTTCTCTCCACTTCGATATC GAAGAATTAAAAAACCTAG-5’。轉錄產物為GTTAAG AAGCTATAGCTTCACCTTCAAGAGAGGTGAAGCTATAGC TTCTTAATT。由上海吉瑪制藥技術有限公司合成并插入到pGPU6/Neo中，生成pGPU6/Neo-Tlr4-Rat-439質粒。SonoVue微泡為Bracco公司產品；超聲儀經顱多普勒超聲（以色列RIMED公司），超聲探頭直徑1.5 cm，超聲頻率2 MHz。Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司），Mini PROTEAN Tetra System電泳儀（Bio-Rad公司），Multimade Plate Reader酶標儀（Enspire-PerkinElmer公司），G-Box凝膠成像系統（G-Box公司）。

1.2 SonoVue/DNA復合物制備 使用0.9%生理鹽水溶液配制SonoVue微泡懸液，通過倒置或振蕩使微泡均勻分布，微泡密度為2×108～5×108/ml，濃度5 mg/ml。實驗前將100 μl SonoVue與100 μl質粒DNA溶液（含5 ng質粒）混勻，4℃保存備用。

1.3 實驗分組及處理方法 Wistar大鼠（雄性，250～300 g，6～8周）購自南方醫科大學實驗動物研究中心，嚴格按照實驗動物管理條例飼養于SPF級環境。實驗動物分4組，每組8只共32只：空白對照組（NS），在正常大鼠側腦室內注入40 μl生理鹽水；裸質粒組（P），在正常大鼠側腦室內注入40 μl質粒溶液（含20 μl質粒）；質粒聯合超聲輻照組（P+S+UTMD），在正常大鼠側腦室內注入40 μl質粒溶液后予以超聲輻照；質粒與SonoVue聯合超聲輻照組（P+UTMD），在正常大鼠側腦室內注入SonoVue/DNA后予以超聲輻照。大鼠予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于立體定位儀上行雙側側腦室注射，每側各注射20 μl，注射后留針5 min，拔針后以無漏液視為注射成功，縫皮后超聲探頭涂布耦合凝膠，對大鼠頭部進行超聲輻照，超聲探頭直徑1.5 cm，超聲頻率2 MHz，深度38 mm，脈沖超聲，輻照部位為前囟沿著中骨縫向后0.8 mm，照射5 min[7]。術后4 d內Berderson評分為0分者視為手術成功（Berderson評分標準：0分：未見行為缺陷；1分：前肢屈曲即提尾懸空實驗陽性；2分：側推抵抗力下降即側向推力實驗陽性，伴前肢屈曲，無轉圈行為；3分：同2分行為，伴自發性旋轉）。4 d后殺鼠取腦，觀察大鼠大腦有無出血點并提取注射部位處大腦蛋白行Western Blot觀察TLR4抑制情況，運用Quantity One凝膠定量分析軟件（Bio-Rad公司）分析灰度值，將樣品與內參灰度值之比進行統計學分析。

1.4 Western Blot 使用Western Blot配膠試劑盒（碧云天產品），按說明書配制12%的電泳膠并將其放入電泳槽中并加入電泳液至水位線。Marker使用10～170 kDa范圍蛋白Marker（500 μl，Tanon公司產品，CatNo：180-6001）取樣品蛋白并用RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation AssayLysis Buffer）將其濃度調至20 μg/μl，按每孔10 μl體積加入電泳膠加樣孔中，合上電極并用80 V恒定電壓跑膠至濃縮膠與分離膠分界線時將電壓調至100 V恒定電壓后繼續跑膠90 min。電泳完畢后取出電泳膠，將泡過10 s甲醇的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜覆蓋其上，將其放入電轉系統中，采用濕性電轉法，以250 mA恒定電流轉移90 min。電轉完畢后取出PVDF膜，以5%脫脂奶粉溶液浸泡并放置在水平搖床上封閉1 h后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗凈，將PVDF膜浸泡于含有1∶2500稀釋的小鼠抗大鼠TLR4多克隆抗體（abcom公司，ab8376）的培養皿中并放置于4℃冰箱中搖動封閉過夜。過夜后將膜取出，以PBS洗膜3次，每次10 min，將膜取出后在盛有1∶5000稀釋的山羊抗大鼠二抗（EarthOx公司，E030110-01）的平皿中在室溫下脫色搖床上搖動孵育1 h后以PBS洗膜3次，每次10 min。PBS洗凈后用ECL發光液（上海偉進生物科技有限公司）于G-Box凝膠成像系統中成像，圖像運用Quantity One凝膠定量分析軟件（Bio-Rad公司）分析灰度值，將樣品與內參灰度值之比進行統計學分析。

1.5 免疫組化染色 每組各取3只大鼠用于免疫組化染色，術后4 d殺鼠取腦，觀察大鼠大腦有無出血點并提取注射部位處大腦，取出后行OCT包埋并作冷凍切片，以13 μm厚度連續切片，每5張取1張貼片后37℃烘片過夜，烘片后3%H2O2室溫孵育20 min，PBS漂洗3次每次3 min，滴加3%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）封閉30 min后滴加經1∶100稀釋的小鼠抗大鼠TLR4多克隆抗體（abcom公司，ab8376）4℃過夜，PBS洗片3次，每次5 min，后滴加山羊抗兔鼠通用二抗（DAKO公司，二抗稀釋比1∶500）室溫孵育50 min。PBS漂洗3次，每次5 min，二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，顯微鏡下觀察出現棕黃色顆粒時停止顯色，蒸餾水沖洗后蘇木精復染細胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，對切片編號以實現盲法觀察，重點觀察取樣部位海馬CA1區錐體細胞的細胞膜及細胞質陽性染色深度。運用Image Pro Plus軟件（Media Cybernetic公司）對免疫組織化學圖片進行平均光度值分析。常規進行HE染色和攝片。

1.6 統計分析 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料符合正態分布采用（s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05差異具有顯著性。

2 結果

實驗中所有大鼠術后4 d內均未出現任何神經功能障礙，4組大鼠Berderson評分均為0分，且無任何大鼠死亡。

2.1 TLR4的蛋白表達情況 4組大鼠TLR抑制后的Western Blot的圖像采用Quantity One凝膠定量分析軟件（Bio-Rad公司）分析灰度值，發現質粒聯合超聲輻照組和質粒與SonoVue聯合超聲輻照組抑制效果明顯（P+S+UTMD：0.223±0.009，P+UTMD：0.277±0.013，t1，3=4.900，P＜0.01；t1，4=8.779，P＜0.01），裸質粒組與空白對照組無明顯差異（NS：0.351±0.030，P：0.339±0.034，t1，2=0.590；P＞0.05），而質粒與SonoVue聯合超聲輻照組與質粒聯合超聲輻照組相比抑制效果更好（P+S+UTMD：0.223±0.009，P+UTMD：0.277±0.013，t3，4=7.006，P＜0.05）（圖1）。

2.2 TLR4抑制后的免疫組化結果 在海馬CA1區，TLR4蛋白的陽性染色為棕黃色顆粒，主要表達在海馬錐形細胞的細胞膜和細胞質（空白對照組TLR4陽性細胞數157.74±2.287；裸質粒組TLR4陽性細胞數147.50±6.461；質粒聯合超聲輻照組TLR4陽性細胞數81.50±5.041；質粒與SonoVue聯合超聲輻照組TLR4陽性細胞數67.75±2.016，每組n=3），平均光度值分析顯示，質粒聯合超聲輻照組和質粒與SonoVue聯合超聲輻照組抑制效果明顯（P+S+UTMD：0.026±0.0013，P+UTMD：0.058±0.0014，t1，3=8.334，P＜0.01；t1，4=21.027，P＜0.01），裸質粒組與空白對照組無明顯差異（NS：0.079±0.0048，P：0.077±0.0012，t1，2=0.797；P＞0.05），而質粒與SonoVue聯合超聲輻照組和質粒聯合超聲輻照組相比抑制效果更好（P+S+UTMD：0.026±0.0013，P+UTMD：0.058±0.0014，t3，4=33.254，P＜0.05）（圖2）。

3 結論

TLR4除特征性識別革蘭陰性菌壁中的LPS外，還能識別機體的各種危險信號（內源性配體），主要的內源性配體是高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）。Hyakkoku等[3]將敲除TLR3，TLR4，TLR9相關基因的3種小鼠短暫大腦中動脈缺血2 h，結果發現只有TLR4基因敲除小鼠的梗死面積縮小且神經功能損傷較小，而其他基因敲除小鼠均無上述表現。Moraga等[8]在敲除TLR4的小鼠大腦中動脈缺血后的第7天發現室管膜下區的神經干細胞數量少于野生型小鼠，但第14天時，神經干細胞數目多于野生型小鼠，可見抑制TLR4能促使神經干細胞數目增多。如果能抑制TLR4表達，將有助于改善腦梗死預后，本課題組曾采用超聲介導載藥微泡的方法成功促進急性腦梗死后的神經再生和血管新生[9]，因此希望能通過超聲介導微泡造影劑攜帶shRNA質粒可以更好地抑制TLR4表達，進一步為體內采用該法進行基因治療打下基礎。

圖1 4組大鼠TRL抑制蛋白表達情況注：超聲探頭直徑1.5 cm，超聲頻率2 MHz，深度38 mm，脈沖超聲，輻照部位為前囟沿著中骨縫向后0.8 mm，照射5 min。圖中可見質粒聯合微泡超聲輻照組TLR4蛋白表達明顯比其他3組要少。而空白對照組和裸質粒組區別不大。TLR4：Toll樣受體4，GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氧酶（內對照）

圖2 大鼠大腦TLR4蛋白表達免疫組化圖注：觀察部位為海馬CA1區。其中A、B、C、D分別為空白對照組、裸質粒組、質粒聯合超聲輻照組、質粒與SonoVue聯合超聲輻照組（x200）。A1、B1、C1、D1分別為空白對照組、裸質粒組、質粒聯合超聲輻照組、質粒與SonoVue聯合超聲輻照組（x400），E、F、G、H分別為空白對照組、裸質粒組、質粒聯合超聲輻照組、質粒與SonoVue聯合超聲福照組的海馬CA1區的HE染色（x200）。圖中箭頭所指為海馬CA1區細胞；HE：蘇木精-伊紅；TLR4：Toll樣受體4

腦缺血可以選擇性地損傷海馬CA1區神經元，而其他亞區的神經元則不受損傷[10-11]，因此，本實驗重點觀察CA1區的TLR4的抑制情況，結果顯示，相較于對照組和裸質粒組，質粒聯合超聲輻照組和質粒與SonoVue聯合超聲輻照組的TLR4蛋白表達明顯減少，因此超聲靶向微泡破裂技術聯合shRNA可能可以有效抑制CA1區錐形細胞的TLR4表達。

RNAi是指在進化過程中高度保守的、由dsRNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。使用該技術可以特異性地結合細胞RNA，導致目的基因的mRNA分解，隨后使相應蛋白質表達下調。當前，RNAi技術的主要兩種類型為化學合成siRNA和shRNA[12-13]。siRNA載體易于轉染到細胞中，在沉默靶基因中效果顯著，但只能短期抑制基因表達[14]。然而，shRNA表達載體可用于體內轉錄并產生shRNA，并生成相應的siRNA，其干擾效果與siRNA相同，而且能夠解決siRNA干擾時間短的缺點，其效果甚至能使靶基因表達減少并維持數周甚至數月[15]。在以往的研究中，shRNA對靶基因的抑制效果良好[16]。在將來的應用中，需要考慮到應盡量減少對患者的操作次數并保持穩定的抑制效率。Liu等[17]使用shRNA抑制Wnt2B2高表達的A549細胞、Hela細胞和PANC1細胞，發現抑制效果可以持續4 d以上。因此，本實驗采用shRNA作為干擾載體，在4 d后提取蛋白發現對TLR4蛋白仍具有抑制作用，證明shRNA抑制效果可以持續4 d。

UTMD是指在特定部位使用特定頻率的超聲輻照，使到達該部位的微泡破裂產生微射流使血管壁或者細胞膜表面出現可逆性的小孔，增加通透性從而使外源性物質如藥物基因載體等更容易進入靶器官或者細胞中從而達到靶向治療目的[18-19]。UTMD技術有3大特點：①安全性，超聲微泡造影劑是一種微氣泡混懸液，可經過人體代謝時間短，可隨著人體呼吸自然排出，毒副作用小；②靶向傳輸的特性，在靶向部位給予一定功率的超聲輻照（包括較高機械指數的診斷超聲），載藥微泡可在特定位置破裂，釋放所攜帶的藥物或基因；③促滲透或轉移的作用，微泡破裂可產生空化效應、微射流等使微血管或細胞出現可逆性的小孔使通透性一過性升高，以促進藥物或基因的滲透[20]。在實驗中，直接注射質粒而不進行超聲輻照時，抑制效果和對照組差異無顯著性，而在超聲輻照的輔助下，質粒聯合超聲輻照組和質粒與SonoVue聯合超聲輻照組與對照組相比，TLR4的表達均有明顯下降。Feichtinger[21]使用可表達骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的質粒并應用超聲輻照成功使質粒轉移至大鼠股骨缺損處，并使其穩定表達，而且觀察到照射部位骨組織生長，但未經過超聲照射部位則無這些表現，可見超聲在基因轉移中的重要性。我們對大鼠進行了超聲輻照，大鼠術后4 d內神經功能評分正常，取腦時未見有出血點。Qiu等[22]在研究中使用2 MHz的低壓超聲聯合質粒-微泡復合物在體外轉染人乳腺癌細胞，乳腺癌細胞生長被抑制并觀察到微泡在乳腺癌細胞上形成的小孔。Guo等[23]使用超聲照射質粒-微泡復合物成功使報告基因在ECV304細胞中表達，說明了通過使用UTMD技術可使基因成功轉染至細胞中并使其表達。陳智毅[24]通過超聲輻照培養皿中的質粒-微泡復合物，結果表明超聲輻照不會影響基因的完整性，照射后質粒結構完整，沒有發生斷裂。而本課題組也在實驗中發現，質粒與SonoVue聯合超聲輻照組相對于質粒聯合超聲輻照組對TLR4有更明顯的抑制作用，可見超聲靶向微泡擊破提高了基因轉染率，可能的機制是通過超聲的聲孔作用以及微泡的空化效應，使胞膜上形成的瞬時孔從而穿透腦脊液-腦屏障[25]。另外，附著在細胞膜上的脂質體微泡與細胞膜親和力較強，可能和細胞膜相互作用，使細胞信號級聯放大[26]。因此，本實驗中抑制效果得到顯著提高。但相較于其他實驗[23，27-28]，本研究采用的側腦室注射法，屬于侵襲性操作，傷害較大，有可能導致腦部TLR4蛋白表達上調[29］。另外，本研究尚未在腦缺血模型中展開，對注射途徑、質粒濃度、微泡濃度也未展開對比分析，觀察時間相對較短，超聲靶向微泡破裂聯合shRNA的具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，超聲微泡造影劑聯合shRNA質粒可高效沉默TLR4基因，該技術有望應用于腦部基因治療，并將為以后非侵襲性的腦部基因傳輸奠定基礎。

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【點睛】

TLR4與腦梗死后癇性發作及預后相關，本研究應用超聲靶向微泡破裂聯合短發夾核糖核酸干擾技術沉默TLR4，有望應用于腦部基因治療，并將為以后非侵襲性的腦部基因傳輸奠定基礎。