MiRNA與血小板活性的研究進展：一個新的評估抗血小板治療效果的潛在生物標志物

林澤明，劉新通

當今心腦血管疾病已成為人類非自然死亡的首要因素。抗血小板藥物被廣泛地應用于心腦血管缺血性疾病的二級預防。盡管抗血小板治療方案的有效性已被證實，但患者對抗血小板藥物的反應性不盡相同，心腦血管意外在二級預防中的再發占有一定比例。因此，在抗血小板的藥物治療中，有效地評估并平衡血栓形成與出血的風險尤為重要。目前臨床上實施的抗血小板治療方案中亟需一個恰當的中間指標，以及時地指導治療劑量和治療時間的調整，使治療效益最大化。

自1993年發現首個微RNA（microRNA，miRNA）[1]至今，關于miRNA與疾病關系的研究進行得如火如荼，為許多難治病的診療提供了新的方法。血小板活性在心腦血管疾病中起著十分重要的作用。若能進一步揭示miRNA與血小板活性的關系，相關疾病的防治定能得到長足的發展。

1 miRNA的概述

miRNA是一種普遍存在于生物體內高度保守的非編碼小RNA分子（約22個核苷酸），以堿基互補配對的方式結合mRNA，參與調控mRNA及基因表達過程中的轉錄后調節，從而達到調控基因表達的目的。作用機制主要為：切割mRNA長鏈；縮短mRNA多聚腺苷尾以降低其穩定性；降低mRNA在核糖體內翻譯蛋白的效率[2]。由此看出，miRNA在調控基因表達方面主要起抑制作用。近年，發現大量的miRNA，目前miRNA數據庫（http：//mirbase.org）已收錄了1881種人類miRNA。

miRNA是生物體進行正常生命活動的一個重要因素。miRNA的異?？蓪е录膊〉陌l生；疾病的發生在一定程度上也體現在miRNA的異常表達上。首個被發現與miRNA相關的疾病是慢性淋巴細胞白血病[3]。隨后，在許多疾病發生的過程中都找到了相應的特異性表達的miRNA[4-5]。目前，已逐漸揭開miRNA與許多疾病的關系，收錄相關研究結果的數據庫miR2Disease（http：//www.mir2disease.org）也得以建立。

2 MiRNA在血小板及血漿含量豐富且十分穩定

血小板是一種由骨髓巨核細胞生成的盤狀的、無核的細胞碎片，它對維持血流穩定及調控血栓形成有著重要的作用[6-7]。盡管人類血小板中缺少DNA，卻含有大量不同種類的miRNA[6]。Landry等[6]通過微陣列芯片等技術發現了大量的血小板miRNA（共219種）。隨著miRNA檢測技術（如深度測序法）的發展，更多的血小板miRNA逐漸為人們所知。Osman等[8]檢測了281種血小板miRNA并列出了其中含量最豐富的20種（表1）。血小板激活時所釋放到血漿的微粒中也包含了大量的miRNA[9]，其中miR-223尤為豐富[8]。

miRNA不僅種類和含量十分豐富，它們在血漿、血清中也十分穩定。Chen等[10]從不同人群提取血清樣本，經過各種嚴苛的處理（包括煮沸、反復冷凍、室溫長時間放置、強酸、強堿、RNase、DNase）后使用熒光定量聚合酶鏈反應檢測miRNA，發現與未經處理的血清檢測結果差異無顯著性，且血漿miRNA在健康中國人種的個體差異性并不顯著。

3 miRNA參與血小板的形成

miRNA在干細胞分化及骨髓各系細胞生成和成熟的過程中的重要性[11-12]，以及某些miRNA在血小板生成過程中的作用被逐漸被揭開。miR-155能結合并抑制與骨髓細胞分化相關的mRNAs從而阻礙造血干細胞分化[11]；miR-28能靶向結合促血小板生成素受體，其表達抑制CD34+細胞來源的巨核細胞的最終分化，且在骨髓增生疾病患者的血小板中過度表達[13]；miR-150表達上調能促使巨核-血紅細胞前體細胞向巨核細胞系而非紅細胞系方向分化[12]。有研究者認為，miR-146a同樣與巨核細胞系祖細胞的形成有所關聯，但具體作用仍存在爭議[14]。表2列出部分miRNA與血小板生成的關系。在血細胞生成的過程中，大部分miRNA主要起抑制作用[11，13，15]，但仍有許多與血小板相關的miRNA的作用機制有待被進一步解析。

4 miRNA表達與血小板活性密切相關

miRNA參與調節血小板mRNAs、蛋白合成及激活，其表達與血小板活性有著密切的關系[6，17-18]。Gidlf等[19]通過RNA測序法，發現在急性心肌梗死患者與健康對照人群中表達具有顯著差異性的9種miRNA。其中8種在病變后表達下調；當中miR-22、miR-185、miR-320b和miR-423-5p含量在血小板上層浮液中增加，但在血栓抽吸后減少，表明miRNA在血栓形成前后的表達有所差異。Osman等[8]則通過對比754種miRNA在血小板靜息及激活（凝血酶刺激1 h后）時的含量，發現了miR-15a、miR-339-3p、miR-365、miR-495、miR-98和miR-361-3p在血小板不同狀態下（激活與否）的含量差異具有顯著性（P＜0.001）。其中miR-15a和miR-339-3p在血小板激活狀態表達下調（分別降低2.5倍和1.4倍），其余4種則上調（miR-365：2倍；miR-495：1.9倍；miR-98：3倍；miR-361-3p：6.5倍）。該研究表明miRNA能反映血小板的激活狀態。Nagalla等[18]將受試者根據其血小板對腎上腺素的反應性高低分成兩組，發現74種miRNA在兩組間的表達具有差異性；miR-200b：PRKAR2B、miR-495：KLHL5和miR-107：CLOCK之間的負相關性在隨后的體外試驗中被進一步得到確認。

表1 血小板中含量最豐富的20種miRNA（從高到低排序）[8]*

此外，許多不同miRNA與血小板激活路徑相關。miRNA在調節P2Y12mRNA的表達上有著重要作用[6]；而miR-223可作為評估P2Y12受體抑制程度的潛在生物標志物[20]；血小板miR-96則在調節囊泡相關膜蛋白8（VAMP8）中具有重要作用[17]。Leonard等[21]發現miR-376c在巨核細胞系中具有調控翻譯磷脂酰膽堿轉移蛋白的mRNA的作用，且miR-376c在不同人種中的表達差異造成了黑色人種血小板通過PAR4受體路徑激活的活性高于白色人種。

以上研究表明，許多miRNA在血小板激活前后的表達有著明顯差異，部分miRNA特異性參與調控血小板激活路徑的某個環節，論證了miRNA與血小板活性具有相關性。實驗中被檢測的血小板miRNA在種類及作用機制上不盡相同，提示這種相關性是體現在血小板激活的不同路徑的各個進程中。

5 miRNA作為潛在的評估抗血小板藥物效力的生物標志物

盡管現在已有一些方法被用來評估抗血小板治療中血小板活性，尚無一種是被認為具有良好臨床應用價值的金標準[22]?，F今評估血小板活性的方法大部分是基于血小板激活的某一條路徑提出的，如P2Y12路徑或COX-1活性。然而血小板激活不是一個單一的過程，而是通過多通道（且其中許多是相互平行的）來實現的[23]。因此，一種能夠良好評估抗血小板藥物對血小板活性作用的方法必須盡可能地覆蓋較多的血小板激活路徑。

miRNA與血小板的生成、mRNAs調控、蛋白合成和激活的各個過程息息相關[6，17]。血小板miRNA是否有可能作為一種潛在的評估抗血小板治療方案效果的生物標志物呢？Willeit等[24]對9名健康志愿者（男性，＜40歲）進行連續4周的抗血小板干預（wk0：空白；wk1：10 mg普拉格雷；wk2：10 mg普拉格雷+75 mg阿司匹林；wk3：10 mg普拉格雷+300 mg阿司匹林），以96孔板血小板凝集測定和血栓素A的形成（作為血栓素B的替代測量）來評估血小板功能，結果表明隨著聯用阿司匹林劑量的加大，血小板抑制現象更為明顯。相應的，通過TaqMan custom plating service特制的方法在不同階段（day0/7/14/21）測定92種miRNA的含量（使用U6做參照），其中8種miRNA發生顯著變化，提示循環中的血小板miRNA能反映血小板激活的程度，血漿miRNA可在一定程度上評估抗血小板治療的效果。Shi等[20]篩選了33例慢性冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患者［（60.91±7.73）歲，接受負荷劑量300 mg阿司匹林+300 mg氯吡格雷24 h或100 mg阿司匹林+75 mg氯吡格雷5 d］，根據其對氯吡格雷的反應，以血小板活性參數（通過血管擴張刺激磷蛋白磷酸化流式細胞術測定）分為正常反應組（血小板活性參數＜56.5%，n=17）和低反應組（血小板活性參數＞56.5%，n=16），并測定兩組患者血清miR-223和miR-96含量。結果表明，雙抗治療方案中，血小板miR-223而非miR-96與血小板活性參數存在統計學相關性（Spearman r=-0.403，P=0.020），從而證明了人體內存在能反映對抗血小板藥物治療反應性的特異miRNA。

然而Christian Stratz等[25]在5名健康志愿者中，分5個不同階段抽取血液樣本（day0/1/3/9：空白；day10：口服單劑量阿司匹林500 mg 24 h后），隨后對不同階段樣本中血小板含量最豐富的20種miRNA[8]進行分析，結果表明單劑量阿司匹林抗血小板并不影響血小板miRNA表達。與Willeit[24]和Shi等[20]的研究結果不同，他認為miRNA的表達與抗血小板治療并無統計學相關性。但該實驗存在一定不足，如樣本量少和單劑量阿司匹林無法代表抗血小板治療。

近年來，在miRNA與血小板活性關系的大量研究中找到許多特異表達的miRNA，并揭示了miRNA在血小板激活的各個進程中的作用機制，且miRNA可作為抗血小板治療方案中評估血小板活性的潛在生物標志物的可能性。然而，將miRNA應用于臨床樣本評估抗血小板治療方案效果的研究數據比較缺乏，且在miRNA對抗血小板藥物的反應性方面仍未完全達至一致。

現況而言，需要更多的相關研究進一步補充臨床樣本中miRNA對抗血小板藥物反應性的數據。此外，除了著重于抗血小板過程中miRNA與血小板活性的定性研究，如何定量地評估兩者的關系并繪制具有臨床應用價值的相關曲線顯得尤為重要。

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【點睛】

與現有評估抗血小板治療效果的方法相比，微RNA具有潛在的更好的臨床應用價值。