腦苷肌肽促進星形膠質細胞分泌GDNF保護AAPH誘導神經元損傷的實驗研究

郭安臣，趙一龍，蘇芳，李巍巍，王擁軍，王群

卒中已成為我國主要的死亡原因之一，而缺血性卒中占卒中的60%～80%，具有高致殘、高致死的特點[1]。除急性期溶栓外，神經保護劑對缺血性卒中患者的康復有重要的意義[2]。腦苷肌肽為復方制劑，是由健康家兔肌肉提取物和牛腦神經節苷脂提取物混合制成的無菌水溶液。主要組分為多肽、多種神經節苷脂、游離氨基酸、核酸等，是目前臨床常用的神經保護藥物。但有關腦苷肌肽保護作用的機制尚有待探討。因此，進一步研究腦苷肌肽在缺血性卒中后的神經保護機制，對于了解缺血性卒中的神經保護及研發新的神經保護劑有重要的意義。

星形膠質細胞是腦內主要的細胞類型，數量超過神經元的5倍以上，對維持神經元的生理功能起到重要作用[3]。而星形膠質細胞可以減輕腦水腫、減少自由基損傷等作用對缺血性卒中有越來越多的意義[4]。近年來，有關星形膠質細胞的神經保護作用日益受到研究者的重視。本實驗從研究腦苷肌肽對星形膠質細胞的影響入手，進一步探討腦苷肌肽對神經元的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗用鼠為SPF級Sprague Dawley（SD）大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。其中，孕16～18 d的SD大鼠（10只）用于神經元培養，生后24 h的SD乳鼠（10只）用于星形膠質細胞培養。

1.1.2 主要試劑及儀器 杜爾伯科極限必需培養基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）、Neurobasal培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購Invitrogen公司。細胞培養板、細胞培養瓶及離心管購自Corning公司。鼠抗神經絲蛋白（neurofilament，NF）單克隆抗體、鼠抗膠質細胞源性神經營養因子（glial cellderived neurotrophic factor，GDNF）單克隆抗體、兔抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽［2，2’-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH］、碘化丙啶（propidium iodide）等購自Sigma公司。Alexa Fluor 568標記的山羊抗兔抗體、 Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠抗體購自Molecular Probes公司。Western Blot相關試劑購自普利萊公司。CCK-8細胞活性試劑盒購自東仁公司。腦苷肌肽由吉林四環制藥有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代神經元培養 用10%水合氯醛將16～18 d孕齡大鼠麻醉后，置于超凈工作臺內，無菌條件下分離出胚胎，轉移到Neurobasal培養基中。取皮層，剔除腦膜、血管，用培養基洗滌2次，剪碎，吹打分散細胞，0.25%胰酶消化10 min，過濾去除所有組織塊，將細胞混懸于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培養基中，接種于24孔培養板中，第2天去除培養板中的培養基，更換為神經元培養基：含有2%B-27添加劑的Neurobasal培養基，之后隔天換液。7 d后用于實驗。

1.2.2 原代星形膠質細胞培養 將出生24 h內的SD乳鼠低溫麻醉后置于75%乙醇中浸泡消毒5 min，無菌條件下去除顱骨，取出腦組織，置于裝有預冷DMEM的無菌玻璃皿中，清洗3次，在解剖鏡下用顯微鑷剝離腦膜及血管，將組織碎塊轉入裝有5 ml 0.25%胰蛋白酶液的離心管內，放入37℃水浴培養箱中消化30 min，加入完全培養基（10%FBS+DMEM+雙抗）終止消化，用吸管吹打20～30次，形成細胞懸液。經70 μm孔徑濾網過濾去除組織碎塊，收取細胞懸液后，1500轉/分離心5 min，去除上清液，重懸細胞后轉移至培養瓶中，置于37℃的5%CO2培養箱中進行培養，2～3 d換液1次，培養7～9 d后使用。

1.2.3 免疫熒光染色 原代培養的神經元和星形膠質細胞經4%多聚甲醛固定30 min后，經磷酸緩沖液（phosphate buffer，PBS）沖洗后加入0.2%Triton-X-100增加細胞膜的通透性，用10%山羊血清封閉抗原位點，鼠抗NF單克隆抗體（1∶400）、兔抗GFAP多克隆抗體（1∶500）分別加入到培養的神經元和星形膠質細胞中。4℃孵育過夜。充分清洗后分別加入Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠抗體（1∶400），Alexa Fluor 568標記的山羊抗兔抗體（1∶400）室溫孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.2.4 AAPH模擬缺血性卒中誘導神經元和星形膠質細胞損傷 AAPH溶于DMEM中制備1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和40 mmol/L的溶液，分別加入神經元和星形膠質細胞中，同時加入CCK-8溶液，作用4 h后，利用分光光度計測定495 nm波長的吸光度，從而分析細胞活力，觀察AAPH對細胞活力的影響。對照組未加AAPH，其他培養條件與AAPH損傷組一致。

1.2.5 腦苷肌肽對AAPH誘導星形膠質細胞損傷的影響 原代培養星形膠質細胞，經傳代純化后，先用40 mmol/L AAPH誘導損傷4 h。更換新培養基并加入0.025 μg/ml、0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的腦苷肌肽作用24 h，之后加入CCK-8檢測細胞活力。對照組未加AAPH，其他培養條件與AAPH損傷組一致。

1.2.6 腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基制備原代培養星形膠質細胞，先用40 mmol/L的AAPH誘導損傷4 h。更換培養基并加入0.1 μg/ml的腦苷肌肽，保護24 h，之后收集培養上清液，經0.22 μm孔徑濾網過濾備用。

1.2.7 Western Blot 原代培養星形膠質細胞，先用40 mmol/L的AAPH誘導損傷4 h。更換培養基并加入0.025 μg/ml、0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的腦苷肌肽，保護24 h。對照組未加AAPH，其他培養條件與AAPH損傷組一致。經裂解、破碎、離心后，用Bradford法進行蛋白定量，調整各樣品蛋白終濃度為20 μg/ml。取20 μl樣品進行電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加相應的GDNF抗體，滴加相應二抗（1∶1000），室溫孵育2 h。PBS清洗，加入增強化學發光液（enhanced chemiluminescence solution）反應1～5 min，觀察蛋白表達情況，并用Image J進行蛋白定量。

1.3 統計與分析 采用SPSS 15.0進行統計分析，符合正態分布的數據以（s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 AAPH能夠模擬卒中制備神經元和膠質細胞損傷模型 原代培養神經元和星形膠質細胞后經神經元和星形膠質細胞特異性的標志物染色鑒定，培養的細胞分別表達神經元特異性標志物NF和GFAP，表明培養的細胞分別為神經元和星形膠質細胞（圖1A，圖1B）。而給予不同濃度AAPH可對神經元和星形膠質細胞造成損傷，細胞活性隨AAPH濃度的增加而下降（圖1C，圖1D）。其中40 mmol/L AAPH可以明顯誘導神經元和星形膠質細胞的損傷。

2.2 腦苷肌肽能夠減輕AAPH誘導的星形膠質細胞的損傷 基于40 mmol/L AAPH能夠誘導星形膠質細胞損傷，在AAPH損傷4 h后，分別給予0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml的腦苷肌肽共同孵育24 h，檢測星形膠質細胞活力。結果表明，不同濃度的腦苷肌肽均能夠減輕AAPH造成的星形膠質細胞損傷，其中0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的腦苷肌肽的保護作最為顯著（圖2）。而0.2 μg/ml的腦苷肌肽未表現出對星形膠質細胞的保護作用。

2.3 腦苷肌肽-星形膠質細胞條件培養基能夠減輕AAPH對神經元的損傷 實驗表明0.1 μg/ml的腦苷肌肽能夠明顯減輕AAPH誘導的星形膠質細胞的損傷作用。因此，本課題選用40 mmol/L AAPH誘導星形膠質細胞損傷，進而繼續加入0.1 μg/ml的腦苷肌肽作用24 h后的細胞上清液作為條件培養基。在40 mmol/L AAPH誘導神經元損傷后加入腦苷肌肽-星形膠質細胞條件培養基作用24 h。檢測神經元細胞活力。結果表明腦苷肌肽-星形膠質細胞條件培養基能夠逆轉AAPH造成的神經元損傷，結果具有統計學意義（圖3）。

2.4 腦苷肌肽-星形膠質細胞條件培養基能夠減輕AAPH誘導的神經元凋亡 PI是一種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）染料，能夠摻入到受損的DNA中，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞不能著色，而損傷及死亡細胞產生紅色熒光，可以作為一種檢測細胞凋亡的指標。我們的實驗表明，在給予腦苷肌肽-星形膠質細胞條件培養基作用24 h后，神經元凋亡的數量和AAPH損傷組相比明顯減少（圖4）。

圖1 AAPH可以模擬缺血性卒中誘導神經元和星形膠質細胞損傷注：原代培養的神經元細胞體較小，突起分支少而較長，能夠特異性表達神經元標志物NF（圖1A）。原代培養的星形膠質細胞，突起分支多而較短，免疫熒光染色表明細胞能夠特異性表達GFAP（圖1B）。AAPH可以模擬腦缺血，10 mmol/L AAPH即可造成神經元的損傷，而對星形膠質細胞20 mmol/L AAPH才表現出損傷作用（“*”表明和對照組差異具有顯著性）。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽；NF：抗神經絲蛋白；GFAP：抗膠質纖維酸性蛋白

圖2 腦苷肌肽能夠減輕AAPH誘導的星形膠質細胞損傷注：40 mmol/L AAPH能夠造成明顯的星形膠質細胞損傷，0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的腦苷肌肽能夠減輕細胞損傷，其中0.05 μg/ml、0.1 μg/ml腦苷肌肽的作用和對照組相比差異具有顯著性（“*”表明P＜0.05）。而0.2 μg/ml的腦苷肌肽未表現出對星形膠質細胞的保護作用。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽

圖3 腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基能夠減輕AAPH誘導的神經元損傷注：和對照組相比，40 mmol/L AAPH能夠誘導神經元損傷，給予腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基后，神經元損傷減輕，細胞活力明顯恢復（“*”表明AAPH損傷和對照組相比細胞活力明顯降低，差異具有顯著性，P＜0.05。“**”表明腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基能夠減輕AAPH誘導的神經元損傷，差異具有顯著性，P＜0.05）。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽

2.5 腦苷肌肽促進星形膠質細胞合成GDNF 原代培養星形膠質細胞經傳代種于25 cm2培養瓶中，AAPH誘導損傷4 h后，分別給予0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的腦苷肌肽共同孵育24 h，收取、裂解細胞蛋白，檢測細胞中GDNF水平。Western Blot結果顯示腦苷肌肽能促進星形膠質細胞合成GDNF，并呈明顯的濃度依賴性。其中0.1 μg/ml腦苷肌肽組的GDNF水平明顯高于AAPH損傷組、0.025 μg/ml腦苷肌肽組和0.05 μg/ml腦苷肌肽組，差異具有顯著性（圖5）。

3 討論

缺血性卒中由于腦部血液供應障礙，能量耗竭造成大腦局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化[5]。而缺血性卒中的治療主要集中在溶栓和神經保護等方面[6-7]，治療的重點是減輕神經元損傷、保護神經元功能。盡管以神經元為中心的神經保護研究取得了一定進展，但由于缺血性卒中病理生理機制極為復雜。同時細胞與細胞之間的相互聯系、相互作用尚不明確，使得神經保護藥物的研究受到極大影響[8]。

星形膠質細胞是中樞神經系統總數量最多的細胞類型，傳統觀點認為星形膠質細胞對神經元提供營養支持[9]。但近來研究發現，在損傷后成熟的星形膠質細胞可去分化為放射狀膠質細胞使得腦損傷功能紊亂的神經系統連接得以恢復[10]。而溴化乙啶可以特異性與膠質細胞DNA和RNA結合，干擾其核酸與蛋白質合成，使得腦缺血模型中星形膠質細胞增生受抑制，梗死灶增大，可見星形膠質細胞可保護腦缺血后的神經元損傷[11]。這使得星形膠質細胞成為神經保護藥物研發的新熱點[12]。

AAPH是一種氧自由基生成劑，能夠在細胞中生成自由基，進而模擬缺血性卒中后自由基對細胞損傷[13-14]。本實驗結果表明，AAPH能夠對神經元造成損傷，但4～6 h等短時間作用于星形膠質細胞能夠增加星形膠質細胞的活性，表明和神經元相比，星形膠質細胞在缺血性腦損傷后對自由基損傷有更強的耐受性，而同時給予腦苷肌肽后的培養基上清液能夠減輕AAPH對神經元的損傷[15]。

圖4 腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基減輕AAPH誘導的神經元凋亡注：碘化丙啶可以標記損傷后凋亡的細胞，實驗給予AAPH后，凋亡細胞明顯增多，而給予腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基后，凋亡細胞明顯減少（“*”表明AAPH損傷和對照組相比凋亡細胞明顯增多，差異具有顯著性，P＜0.05。“**”表明腦苷肌肽－星形膠質細胞條件培養基能夠減少細胞凋亡，差異具有顯著性，P＜0.05）。注：AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽

圖5 腦苷肌肽促進星形膠質細胞合成GDNF注：腦苷肌肽能夠促進星形膠質細胞合成GDNF，不同濃度的腦苷肌肽作用于星形膠質細胞24 h后，星形膠質細胞表達GDNF隨著腦苷肌肽濃度的增加而增多。其中，0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的腦苷肌肽作用組和對照相比差異具有顯著性（P＜0.05）。GDNF：膠質細胞源性神經營養因子

腦苷肌肽具有神經保護作用。腦苷肌肽系由健康家兔肌肉提取物和牛腦神經節苷脂提取物混合制成的無菌水溶液。其主要組份為多肽、多種神經節苷脂、游離氨基酸、核酸等。既往研究表明，腦苷肌肽具有神經保護作用，能夠通過消炎等機制保護神經元，臨床應用同樣表明，腦苷肌肽能夠減輕缺血性卒中患者癥狀，改善功能，促進恢復[16]。本實驗通過體外細胞培養，發現腦苷肌肽-星形膠質細胞條件培養基能夠降低AAPH誘導的神經元凋亡，增加神經元細胞活性。表明腦苷肌肽具有神經保護作用。

腦苷肌肽的保護作用是通過促進星形膠質細胞合成分泌GDNF間接發揮作用。GDNF是由膠質細胞分泌的一種神經生長因子，對神經元有明顯的保護作用[17]。動物實驗表明，預先定位側腦室注射GDNF，可有效對抗腦缺血后神經元的凋亡[18]。在永久性腦缺血模型中給予GDNF，同樣可減小梗死灶，減輕腦水腫，抑制神經元凋亡[19]。本研究通過離體細胞培養發現腦苷肌肽不僅能夠減輕AAPH誘導的星形膠質細胞損傷，同時腦苷肌肽作用于AAPH刺激的星形膠質細胞，可以增加星形膠質細胞合成GDNF，從而發揮保護神經元的作用。

腦苷肌肽具有神經保護作用，其發揮神經保護作用的一種可能機制是促進星形膠質細胞合成膠質細胞源性神經生長因子。同時實驗表明星形膠質細胞是神經保護作用的一個靶點，通過保護星形膠質細胞能夠達到保護神經元進而促進卒中患者康復的作用。

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【點睛】

本實驗通過體外研究發現星形膠質細胞是卒中后神經保護的重要靶點，對神經保護新藥的研發有重要的理論指導意義。