阿霉素對乳腺癌干細胞的體外作用研究

于曉軍

（吉林省吉林市中西醫結合醫院乳甲外科，吉林 吉林 132012）

阿霉素對乳腺癌干細胞的體外作用研究

于曉軍

（吉林省吉林市中西醫結合醫院乳甲外科，吉林 吉林 132012）

目的通過實驗觀察研究阿霉素對于乳腺癌干細胞的病理藥理的作用，從而來研究乳腺癌細胞系MCF-7干細胞通過使用了藥物阿霉素在其體外所產生的變化，來選擇乳腺癌干細胞更有針對性的治療方案和研究比較更加行之有效的藥物。方法使用流式細胞儀器，在乳腺癌細胞系（MCF-7），剝離乳腺癌干細胞CD24（-/low）、CD44（+）、ESA（+）。在濃度不同的阿霉素培養液中放置乳腺癌干細胞與沒有進行分揀的細胞，測得阿霉素對不同干細胞的抑制生長生，進行細胞凋亡及克隆形成能力的分析。結果MTT表明乳腺癌干細胞具有耐藥性。藥物阿霉素呈濃度依賴型抑制了乳腺癌未分類細胞及干細胞：未分類細胞IC50為5.5 μmol/L；而分選出的干細胞IC50為29.1 μmol/L（P＜0.001）。乳腺癌干細胞在使用藥物阿霉素可加速病變的恢復，隨著用藥時間的增加其效果愈加明顯。研究中還發現，乳腺癌干細胞在阿霉素的作用下可減少其形成和擴散。結論乳腺癌干細胞在使用了藥物阿霉素成瘤性有所降低，對于其克隆能力具有抑制作用，其變化呈時間依賴型與濃度依賴型。

乳腺癌；干細胞；阿霉素

相關研究發現，有極少的腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）包含于腫瘤細胞當中，這些干細胞不僅具有分化成各種不同類型腫瘤細胞的能力，而且具有長時間的自我更新能力，這些特性決定了其在惡性腫瘤的發生、發展中發揮了極其重要的作用[1-2]。

阿霉素（adriamycin，ADM）是具有細胞周期非特異性的藥物，可以有效的殺死有害細胞，有很好的抑制腫瘤細胞克隆的作用，是乳腺癌化學治療常用藥物[3]。研究人員在含有了濃度不一樣的阿霉素干細胞培養液中放置未分類細胞以及乳腺癌干細胞，觀察阿霉素在干細胞移植動物模型中發揮的抑制作用，檢測阿霉素對MCF-7干細胞生長的抑制曲線，分析乳腺癌干細胞在使用阿霉素時準確的效果。

1 材料與方法

1.1 材料：人體乳腺癌細胞系MCF-7的細胞株。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳腺癌干細胞：使用流式儀分選出ESA（+）、CD44（+）、CD24（-/low），放置于6孔板或96孔板。將干細胞置于培養液中：含20 ng/mL EGF，1∶50 B27，4 μg/mL 胰島素DMEM，F12（1∶1）的培養液，0.400%牛血清白蛋白，阻止干細胞分化情況[4-5]。

1.2.2 MTT實驗：利用MTT方法（the 3-（4-5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromidedye reduction assay），比較阿霉素對乳腺癌未分類細胞以及干細胞的作用影響。不同藥物濃度的96孔板中每一濃度設5個復孔放置沒有進行分類的MCF-7細胞與干細胞，在培養箱中37.0 ℃的實驗溫度，5.0% CO2下進行；阿霉素的作用濃度分別為0.1、1、10、50、100 μmol/L；藥物作用24 h后，每孔注入MTT 20 μL（將PBS配成5 mg/mL）然后繼續培養4 h之后結束，進行去除無關液體的處理之后，混合DMSO 150.0 μL，搖勻處理10 min。觀察光吸收值（OD值），每組重復3次試驗，把記錄的結果標注。在SSPS18.0軟件中輸入實驗數據，得出抑制濃度IC50。

1.2.3 檢驗細胞調亡變化，檢測細胞凋亡率，檢驗阿霉影響素干細胞凋亡的情況。通過軟克隆瓊脂的實驗，在40×10鏡下觀察其變化。記錄超過30個細胞菌落的細胞數量。重復進行3次試驗。

2 結 果

2.1 MCF-7干細胞比例。本實驗結合了現在醫學界常用的乳腺癌干細胞的表型：CD24（-/low），CD44（+），ESA（+），對乳腺癌細胞系MCF-7進行干細胞的分選。其中，MCF-7中干細胞占了（1.4±0.26）%。

2.2 MTT實驗結果：阿霉素作用的濃度梯度為0.1、1、10、50、100 μmol/L，作用時間均為24 h。使用MTT的檢測方法發現，阿霉素抑制了乳腺癌細胞的克隆，并且隨著藥物作用的濃度的增加跟隨增加。MCF-7乳腺癌干細胞要比未分類的乳腺癌細胞更具有耐藥性：其中未分類細胞IC50為5.5 μmol/L；而分選出的干細胞IC50為29.1 μmol/L（P＜0.001）。

2.3 阿霉素作用于干細胞對其凋亡的影響：進行分析干細胞早期的凋亡。結合對照組（3.180±1.060）%早期凋亡率對比，阿霉素在實驗24、48、72 h之后MCF-7干細胞凋亡率為（8.30±0.45）%、（10.29± 0.87）%及（14.79±1.53）%，具有統計學的意義（P＜0.01），且凋亡率與藥物作用時間成正比，呈時間依賴性。72 h后阿霉素在作用于乳腺癌的原代干細胞時可達到最大值，并誘導干細胞早期的凋亡，具有統計學意義。

2.4 乳腺癌干細胞結合阿霉素時體外克隆能力的影響：在本實驗中，MCF-7干細胞在分別在含或不含10 μmol/L阿霉素藥物的培養液中培養了兩周時間，40×10鏡下觀察克隆進行的變化。鏡下選取隨機4點進行克隆的計數取其平均值。在實驗中結合對照組的克隆率為100%，阿霉素組中的克隆率為（60.50±7.54）%（P＜0.001），兩組間的克隆形成有顯著區別。

3 討 論

當今以研究乳腺癌干細胞的試驗研究不多，在研究中發現阿霉素在乳腺癌干細胞中發揮的作用。實驗表明阿霉素可有效抑制腫瘤干細胞發展。這將為阿霉素進一步應用在臨床治療上提供了依據。

通過對體外克隆形成能力及細胞凋亡的實驗表明：在結合未分類細胞時效果相似，可以降低體外克隆的干細胞，而且乳腺癌干細胞在使用阿霉素之后可以早期凋亡。研究表明阿霉素對乳腺癌干細胞的效果和克隆形成及早期凋亡密切相關。鄭建勇等[6]誘導肝癌細胞HCC-9204凋亡時使用阿霉素，結果發現了BCL-2細胞大量凋亡，蛋白大量減少。王文武[7]等建立了MCF-7細胞建立了小鼠模型，研究結果表明：阿霉素有加速小鼠MCF-7乳腺癌的細胞凋亡和抑制其克隆的作用。綜上所述表明，抑制增殖乳腺癌干細胞、誘導細胞凋亡可以通過使用阿霉素來實現。

綜上所述，阿霉素具有一定耐藥性，但在一定程度上它可以抑制乳腺癌干細胞生長。在抑制乳腺癌干細胞生長機制方面可能與可以加快乳腺癌干細胞的早期凋亡、降低體外復制形成能力相關，它的抗腫瘤作用機制，還要繼續實驗挖掘與完善。

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R737.9

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1671-8194（2015）02-0057-02