shRNA表達(dá)載體沉默BHRF1對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞周期的影響

張艷平 丁 矢* 李雪蘭 楊 杰 唐 峰 歐 勇

（常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南 常德 415100）

shRNA表達(dá)載體沉默BHRF1對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞周期的影響

張艷平 丁 矢* 李雪蘭 楊 杰 唐 峰 歐 勇

（常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南 常德 415100）

目的探討沉默shRNA對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞周期的影響。方法構(gòu)建負(fù)載BHRF1 shRNA的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染至CNE2細(xì)胞，采用MTT法觀察轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h的增殖抑制率，采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。結(jié)果BHRF1 shRNA可增加CNE2細(xì)胞增殖抑制率，96 h時(shí)達(dá)最大，各時(shí)間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染48 h后的凋亡率增加，G1/G0期細(xì)胞比例均高于對(duì)照組，S、G2/M期細(xì)胞比例低于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論沉默BHRF1可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)G1/G0期阻滯及細(xì)胞凋亡。

shRNA；BHRF1；鼻咽癌；生長；凋亡

鼻咽癌為一種惡性頭頸腫瘤，發(fā)病隱匿，惡性度高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)提高了鼻咽癌局控率，但總生存率仍較低。故研究其發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)提高其療效意義重大[1]。EB病毒感染可能為鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的有關(guān)，而EB病毒早期基因BHRF1為近年來新確認(rèn)的一種EB病毒致癌基因，與原癌基因bcl-2同源，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[2]，故探討以BHRF1為靶點(diǎn)對(duì)EBV相關(guān)鼻咽癌進(jìn)行治療具有巨大的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：CNE2細(xì)胞株購自美國ATCC公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）及Tris購自美國Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶購自美國Gibco公司；PI細(xì)胞周期流式檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。負(fù)載BHRF1 shRNA的慢病毒載體由北京諾賽公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞增殖檢測：制備對(duì)數(shù)生長期CNE2細(xì)胞單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后轉(zhuǎn)染BHRF1 shRNA慢病毒（取未處理者為對(duì)照），常規(guī)條件下培養(yǎng)24、48、72和96 h后，加入MTT溶液并讀取492 nm的吸光值A(chǔ)，根據(jù)公式計(jì)算增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）×100%。

1.3 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測：按1×106/孔接種細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染BHRF1 shRNA慢病毒（取未處理者為對(duì)照），常規(guī)條件培養(yǎng)48 h后，依據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書操作，PBS沖洗細(xì)胞1次，15 min后采用流式細(xì)胞儀測定凋亡率及細(xì)胞周期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差進(jìn)行多組比較，SNK法行兩兩比較，采用SPSS 18.0軟件分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染BHRF1 shRNA載體24、48、72及96 h的增殖抑制率分別為（7.21±0.56）%、（16.55±2.71）%、（25.08±3.14）%和（38.44±3.39）%，其中96 h時(shí)達(dá)最大程度抑制，各觀察點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞凋亡：shRNA載體組的早、晚期凋亡率分別為（8.21± 0.75）%和（26.15±3.39）%，均高于對(duì)照組的（3.45±0.46）%和（9.22±1.12）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞周期：shRNA載體組的G1/G0期細(xì)胞比例為（78.51±3.83）%，高于對(duì)照組的（55.24±2.59）%，S、G2/M期細(xì)胞比例分別為（13.47±2.65）%和（7.66±0.92）%，低于對(duì)照組的（28.15±2.08）%和（12.73 ±1.69）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

BHRF1為EBV裂解早期表達(dá)的蛋白，近年來備受關(guān)注的導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病毒癌基因[3]。BHRF1基因位于EBV基因組，編碼17 kDa蛋白質(zhì)，屬于bcl-2家族。BHRF1蛋白有25%的氨基酸序列與人類原癌基因bcl-2的編碼蛋白同源，42%的序列相似，而C區(qū)38%的氨基酸序列與bcl-2序列同源[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)BHRF1有原癌基因的作用[5]，但目前其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用尚不清楚，故本研究采用RNA干擾技術(shù)，在人鼻咽癌CNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染將負(fù)載BHRF1 shRNA慢病毒載體，觀察BHRF1基因沉默對(duì)CNE2細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染BHRF1 shRNA可抑制CNE2細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為隨觀察時(shí)間的延長，增殖抑制率升高，且96h達(dá)最大抑制效果，主要與慢病毒可較長時(shí)間的表達(dá)有關(guān)，可起到長期抑制CNE2細(xì)胞增殖的效果。此外，轉(zhuǎn)染48 h的CNE2細(xì)胞凋亡率升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示沉默BHRF1后可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡，主要與BHRF1與原癌基因bcl-2同源，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，故當(dāng)沉默其表達(dá)后細(xì)胞早、晚期凋亡率均增加。細(xì)胞周期紊亂為腫瘤細(xì)胞的基本特征之一，轉(zhuǎn)染BHRF1 shRNA后可引起G1/G0期細(xì)胞比例升高，S、G2/M期細(xì)胞比例降低，表明沉默BHRF1表達(dá)后可引起細(xì)胞周期的G1/G0期阻滯。綜合以上證據(jù)，說明BHRF1蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞抵抗凋亡的能力，BHR F1基因的表達(dá)可抑制細(xì)胞的終末分化和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，沉默BHRF1可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)G1/G0期阻滯及細(xì)胞凋亡，在鼻咽癌的輔助治療中，有一定的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。

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[4]孔祥碩,李欣,羅兵,等.BHRF1基因?qū)z裂霉素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡影響[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(5):377-380.

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R739.6

B

1671-8194（2015）05-0055-01

2012年度湖南省高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目12C0968

*通訊作者