泛素蛋白酶體通路及其與動脈粥樣硬化斑塊關聯研究進展

龐軍、程文立綜述，張鉦審校

泛素蛋白酶體通路及其與動脈粥樣硬化斑塊關聯研究進展

龐軍、程文立綜述，張鉦審校

泛素蛋白酶體系統（UPS）是細胞內非溶酶體途徑蛋白降解通路,在生物體內負責大多數細胞周期過程中蛋白降解及異常蛋白降解，可維持蛋白質穩定狀態、調節細胞程序性死亡、控制細胞周期、條件信號轉導通路、介導受體內吞、I型抗原加工呈遞和炎癥反應等。當前相關研究顯示，泛素蛋白酶體通路通過炎癥機制促進動脈粥樣硬化相關疾病的發生發展。故本文就UPS的組成及其在動脈粥樣硬化發生發展中作用的新進展、前景做一綜述。

泛素蛋白酶體通路;動脈粥樣硬化機制

泛素蛋白酶體系統（UPS）是真核生物細胞內高度保守的多肽，是三磷酸腺苷（ATP）依賴性的，細胞內非溶酶體途徑蛋白降解通路，在生物體內負責大多數細胞周期過程中的蛋白降解，包括凋亡，基因轉錄，細胞信號通路和溶酶體消化過程等[1]。同時，UPS可降解異常蛋白，如未折疊蛋白，受損蛋白，變異及錯誤轉錄蛋白，故UPS對于維持細胞正常功能發揮著重要作用。先前研究顯示UPS能促進心血管疾病發展[2]。本文簡短綜述當前關于泛素蛋白酶體結構和功能的研究，闡述泛素蛋白酶在動脈粥樣硬化進程中發揮的作用。

1 泛素蛋白酶體結構及功能

泛素是廣泛分布在真核細胞中的小分子球狀蛋白質體系，為高度保守結構，占細胞蛋白總量的近1%。單個泛素分子由76個氨基酸組成，分子量8.5 KD。泛素分子折疊為球形，由5個B層形成一個腔，內部a螺旋為對角線結構，為泛素折疊、這個蛋白質含有明顯疏水核心和大量氫鍵，故可維持泛素結構穩定性，防止在結合和降解過程中變性失活。泛素是由76個氨基酸組成的高度保守多肽，廣泛分布于各類細胞，與基質蛋白酶相關[3，4]。分子量為8.45 KD，是一種非常小的球形蛋白，也是能量依賴性的泛素蛋白酶體的重要組分，常與其他蛋白質共價結合發揮生物學作用。泛素廣泛存在于所有真核組織細胞中，序列相當保守，其氨基酸序列從昆蟲到人類基本相同。

泛素體系主要由泛素、泛素激活酶（E1）、泛素綴合酶（E2）、泛素連接酶（E3）及26S蛋白酶體組成[5]，其活性中心在26S蛋白酶體中。泛素降解細胞內蛋白質的簡要過程如下：泛素被E1激活并連接到其半胱氨酸殘基上，然后通過轉酰基作用進一步轉移到E2的半胱氨酸殘基上。泛素可以直接從E2轉移給底物蛋白形成泛素-蛋白復合物，或與E3蛋白復合物結合，多個泛素單元可形成多聚泛素鏈[6]。E4（UFD）與E3蛋白復合物結合，多個泛素單元可形成多聚泛素鏈。E4作用可能是與較短的泛素鏈結合促進長泛素鏈的形成。泛素—蛋白復合物主要被26S蛋白酶識別降解，同時由泛素C端水解酶釋放泛素再循環利用[7]。

E1：為泛素與底物蛋白結合的第一個酶，通過其活性位點的半胱氨酸殘基與泛素的C末端形成高能硫酯鍵而激活泛素[8]，是細胞活性和生存所必須的酶。泛素綴合酶E2：為小分子蛋白質，核心區域內含有活性所需的半胱氨酸殘基[9]，可催化泛素與底物蛋白之間形成異肽鍵。E2介導的是泛素分子經過轉硫醇反應從E2半胱氨酸殘基轉移給E2活化的半胱氨酸位點。E2同時與E1及E3S連接，主要發揮轉運泛素分子到靶蛋白上的作用[10，11]。泛素連接酶E3：E3決定底物的選擇，可催化泛素與底物結合，目前主要有3種類型E3s：含有HECT結構域的E3s，含有環指狀結構域或患有U-box結構域的E3s。E4：一種能通過與較短的泛素鏈結合，而促進長泛素鏈形成的蛋白質。

26S蛋白酶體：是降解泛素化底物的一個ATP依賴型蛋白水解復合體，由20S核心蛋白酶（CP）和19S調節顆粒（RP）結構組成[12]，主要作用是將胞質內蛋白質裂解為短肽片段，此酶體功能可被蛋白酶體抑制劑抑制。20S 蛋白酶體含有類糜蛋白酶活性、類胰蛋白酶活性、谷氨酰水解酶活性、支鏈氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性等多種活性，可介導靶蛋白的水解。

泛素再循環酶：包括泛素C-末端水解酶（UCHs）、同工肽酶、去泛素化酶多種酶，能通過水解多聚泛素鏈和促進泛素形成以維持游離泛素的濃度，同時可以調整錯誤標記的泛素，使其去泛素化，同時可將多聚泛素鏈從26S蛋白酶上分離以保證識別準確度。

2 泛素蛋白酶體降解蛋白的步驟

多個泛素被激活、轉運，分別通過E1、E2、E3連接于靶蛋白上，形成多聚泛素鏈，然后多聚泛素鏈標簽的靶蛋白被26S蛋白酶體復合物識別和降解[13，14]。具體步驟如下：第一步：E1、E2、E3共同作用下，將泛肽C端羧基與底物蛋白賴氨酸殘基ε氨基形成異肽鍵[15]，后續泛肽以類似方式連接成串，完成底物蛋白多肽化標記。第二步：26S 蛋白酶體兩

端的19S調節亞基識別、結合泛素的底物蛋白，在26S 蛋白酶體催化核心20S亞基的催化作用下，將蛋白酶水解為多肽，繼而多聚泛素鏈在泛素再循環酶作用下釋放出泛素以供重新利用，形成泛素的再循環途徑。歸納起來，就是：第一步，底物識別，識別底物的特殊降解信號；第二步，泛素與底物的共價連接，在ATP提供能量的同時，將多個泛素連接到底物上形成多聚泛素鏈；第三步，降解底物蛋白，釋放出游離泛素。

3 泛素蛋白酶體的功能及與動脈粥樣硬化關聯

UPS的功能：對于細胞的生理功能方面起著非常重要的作用，UPS為細胞內蛋白質降解的主要途徑，UPS的功能狀態對于細胞的存活來說具有決定性作用，可通過泛素連接酶MDM-2抑制細胞凋亡轉錄因子p53的生理活性[16]，下調細胞周期抑制因子如周期素依賴激酶受體p21的表達，從而減少促細胞凋亡因子Bax的表達，故在炎癥、增殖和細胞凋亡等細胞重要病理生理過程中也可發揮重要作用。

UPS與動脈粥樣硬化關聯：動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥病理過程，是在多種損傷危險因素作用下導致的炎癥反應。損傷性刺激可在內源性氧化應激作用下加劇，通過脂質、蛋白質、DNA的氧化修飾而引起血管壁結構功能的改變。泛素蛋白酶體廣泛降解異常及短命的蛋白質，調節機體穩態，參與動脈粥樣硬化多種病因學說的致病過程。動脈粥樣硬化是由損傷刺激對動脈壁造成的炎癥增殖反應所致，核因子-kB（NF-kB）在核因子κB抑制蛋白（IkB）參與下介導動脈粥樣硬化—增殖反應。從病理病變進展角度，動脈粥樣硬化分為脂紋期、進展期，于動脈粥樣硬化病變早期脂紋期，冠狀動脈壁有大量泛素化蛋白聚集，蛋白體活性增強，于動脈粥樣硬化進展期，損傷部位炎癥細胞浸潤，纖維斑塊形成。血管平滑肌細胞從收縮型向增殖型轉化。而這些動脈粥樣硬化斑塊內膜基底部，泛素蛋白酶相關蛋白表達上調，導致斑塊不穩定性增強，導致心血管事件發生概率增加。同時UPS還在巨噬細胞、泡沫細胞聚集方面發揮作用，可通過聚集的低密度脂蛋白誘導泛素蛋白表達增多，以降解低密度脂蛋白，促進細胞凋亡。故泛素蛋白酶與動脈粥樣硬化的發病過程及進展病理過程密切相關[17]。

動脈粥樣硬化是損傷性刺激啟動的炎性增殖反應。內皮細胞可產生NO，通過提高NF-kB的活性以拮抗動脈粥樣硬化啟動。研究表明，抑制UPS能上調NO合酶表達，促進NO合成。在嚴重氧化應激情況下，UPS在NF-kB的激活中起了關鍵作用。

血管平滑肌細胞增殖性病變是動脈粥樣硬化發展階段的主要特征。UPS可促進血管平滑肌細胞發生功能性改變，使其收縮功能降低[18]。UPS可促進損傷區域新生血管內膜形成，導致細胞凋亡增加。

不穩定性斑塊具有纖維帽薄、脂質核心大、膠原產物少、膠原降解增加，與炎性細胞浸潤、血管細胞凋亡有關。T細胞是動脈粥樣硬化的特征性炎癥成分，與斑塊進展和破裂相關。T細胞激活增加UPS特性，增加腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）釋放，導致血管平滑肌細胞凋亡。炎性細胞因子增加了血管平滑肌細胞表面死亡受體Fas-CD95表達，啟動外源性細胞凋亡途徑[19]。另一方面，UPS可降解短壽命促凋亡蛋白p52、Bax、p27，而在不穩定的動脈粥樣硬化斑塊中，由于氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）作用，導致UPS功能損傷而使促凋亡蛋白增多，使細胞周期停滯并凋亡。故UPS與不穩定動脈粥樣硬化斑塊的形成與發展相關。

UPS可通過調節炎癥反應在動脈粥樣硬化進展過程中發揮作用：轉錄因子NF-kB是許多因素促進動脈粥樣硬化發生發展的共同通路[20]，低密度脂蛋白（LDL）、血管緊張素II（AngII）、長期高血糖、巨噬細胞、肺炎衣原體感染等都可以激活NF-kB，使下游的IL-1和細胞間黏附分子（ICAM-1）增加，啟動炎癥反應，促進動脈粥樣硬化發生。NF-kB的生物學效應受到IkB的抑制，IkB在被26S降解的過程中釋放NF-kB啟動轉錄；蛋白酶體抑制劑MG132處理可抑制IkB的降解，從而抑制其激活和轉錄。由此可見，蛋白酶抑制劑可能上調IkB，阻斷NF-kB的激活及下游的炎癥反應[21]。

泛素蛋白酶體可通過調節細胞凋亡、脂質代謝、氧化損傷影響動脈粥樣硬化進程：對細胞凋亡的影響：巨噬細胞脂蛋白誘導基因的mRNA明顯增高，這種細胞一般經LDL處理，導致細胞凋亡減少，泡沫化細胞增多。研究報道該蛋白類編碼蛋白與泛素結合酶中一款蛋白同源，加入蛋白酶抑制劑處理則可抑制該蛋白表達，提示泛素蛋白酶體通路可能在巨噬細胞凋亡、泡沫細胞形成中發揮作用。泛素蛋白酶體對脂質代謝的影響：泛素蛋白酶體及蛋白酶體抑制劑可共同調節載脂蛋白影響脂質代謝。載脂蛋白A（apoA）主要存在于血漿LDL中，可受蛋白酶體抑制劑乳胱素和蛋白酶體抑制劑ALLN調控，以抑制apoA降解并促進它與脂質的結合及分泌，增加血漿apoA的水平。蛋白酶體抑制劑ALLN及MG132都可延長細胞內LDL受體相關蛋白類的的半衰期，增加其在細胞表面的表達，從而促進脂質清除，降低粥樣斑塊形成[19]。ApoB可組裝乳糜微粒及LDL，從而發揮調節LDL清除的作用。蛋白酶體抑制劑可能抑制泛素化的apoB降解，上調apoB的表達。ApoE與動脈粥樣硬化敏感性相關，泛素蛋白酶體可降解apoE，而蛋白酶體抑制劑如乳胱素可導致apoE聚集，降解速率減慢。泛素蛋白酶體與氧化損傷：氧化損傷可促使細胞可產生有害物質，如NF-kB，若給予蛋白酶體抑制劑可抑制NF-kB活性[22]。

除上述途徑外，泛素蛋白酶體還可以通過其他機制調節動脈粥樣硬化。用蛋白酶體抑制劑MG132處理牛肺動脈內皮細胞及人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），內皮型eNOS的mRNA及蛋白質表達呈劑量依賴性增加。將大鼠頸總動脈組織環和MG132共同培養，組織環呈內皮細胞源性NO依賴式舒張，提示蛋白酶體抑制劑可能通過促進eNOS的產生延緩血管重塑。

Versari等[23]對于患者動脈硬化斑塊進行了泛素的檢測，結果顯示，在動脈粥樣硬化斑塊中，當泛素蛋白酶的活性受到抑制時，氧化應激反應加劇，該反應尤其存在于有臨床癥狀的患者中。故提示泛素蛋白酶與斑塊穩定性具有關聯。提示泛素是動脈粥樣硬化過程的保護因素，可以通過降解氧化的及受損傷蛋白而抑制動脈粥樣硬化進程。同時有報道稱在感染艾滋病患者中應用蛋白酶抑制劑，可提高其動脈粥樣硬化的發病機率[24]。

Sozen等[25]研究顯示，泛素蛋白酶可通過c-jun氨基末端激酶-1（JNK-1）磷酸化作用及蛋白激酶-1（AP-1）的作

用而調節基質金屬蛋白酶（MMP）的表達，從而減少動脈粥樣硬化的進程。同時，相關研究顯示，高密度脂蛋白（HDL）在動脈粥樣硬化中的保護作用是通過P2Y13受體的作用而完成的，而泛素在該受體的表達調節中發揮了重要作用[26,27]。

泛素抑制劑的相關研究也顯示了泛素蛋白酶在動脈粥樣硬化方面發揮的作用。通過泛素抑制劑沉默動脈粥樣硬化中NF-kB通路已在細胞實驗及動物模型試驗方面顯示了其對于相關疾病的治療前景。當前許多新的研究關注方向不只將泛素蛋白酶抑制劑僅僅作為一種炎癥抑制因子，且將其作為潛在的藥物治療方法。因此，關于泛素蛋白酶和其抑制劑的研究將會為心血管疾病的治療提供新思路[28]。

綜上所述，泛素蛋白酶體是細胞內ATP以來的蛋白質選擇性降解的主要途徑，是真核細胞內重要蛋白質調節系統，除了參與細胞內正常生理過程調控外，在動脈粥樣硬化發病進程中也發揮重要作用。隨著科學技術的發展，泛素蛋白酶體途徑會進一步顯明，從而促進人們對于泛素蛋白酶體的認識和對于動脈粥樣硬化機制的進一步理解，從而對于疾病防治有著進一步指導作用。

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2015-01-28）

（編輯：常文靜）

國家自然科學基金（81173420）

730000 甘肅省蘭州市，蘭州大學第一臨床醫學院 心內科（龐軍、張鉦）；中日友好醫院 心內科（程文立）

龐軍 住院醫師 博士研究生 主要研究方向為心血管疾病臨床及科研 Email: feixudiandian@163.com 通訊作者：程文立 chengwenli2013@163.com

R54

A

1000-3614（2015）09-0913-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.021