微小核糖核酸與干細胞移植治療心肌梗死的研究進展

王艷綜述，石蓓審校

微小核糖核酸與干細胞移植治療心肌梗死的研究進展

王艷綜述，石蓓審校

微小核糖核酸（miRNAs）是一種內源性非編碼調控單鏈小分子核糖核酸，可通過與目標信使核糖核酸（mRNA）結合，調控基因的轉錄后翻譯過程。有研究顯示miRNAs參與修復受損心肌。此外，越來越多的研究發現不同的miRNAs可參與干細胞功能調控，調節干細胞存活、遷移、分化等過程，進而通過改善移植干細胞命運，提高心肌梗死后心功能。本文旨在對miRNAs與干細胞移植治療心肌梗死的研究現狀及所面臨的問題進行綜述。

心肌梗死；微小核糖核酸；干細胞移植；再生治療

冠狀動脈疾病在我國乃至全球發病率及死亡率都高居首位，其中心肌梗死是臨床常見急危重癥，目前的治療方法雖然能顯著改善心肌梗死患者的臨床預后，但是因壞死的心肌細胞難以再生，存活的心肌經歷了缺氧及心臟重構，致使心臟功能嚴重受損。目前干細胞移植治療心肌梗死，被認為是再生壞死心肌細胞，修復梗死心肌最具前景的治療方法，各種類型干細胞已用于實驗及臨床研究，然而不管何種類型干細胞均存在自身優勢與局限性[1]。骨髓間充質干細胞移植治療心肌梗死可顯著改善其心功能，然而也有研究顯示了骨髓間充質干細胞分化為心肌細胞的不確定性，近期的幾個大型臨床實驗中對骨髓間充質干細胞移植治療心肌梗死的確切療效亦無突破性進展[2，3]。 胚胎干細胞及多能誘導干細胞是到目前為止是最具潛力替代壞死心肌的種子細胞源，但首先得解決其臨床應用的安全性及倫理問題。心臟干細胞不僅可定向分化為心肌細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞，并具有組織特異性與低免疫原性等特點。心肌損傷后，大部分心臟干細胞即進入細胞周期、復制并定向分化為心肌細胞譜系，顯著改善心肌梗死后心功能[4]。且心臟干細胞在I/II期臨床試驗中均獲得可喜的成果[5，6]。然而van Berlo等[7]近期的一項研究發現，成年及慢性疾病的小鼠心臟受損后，心臟固有干細胞確實能產生出新的心肌細胞，但所占百分率僅為3%或更低。可能在改善心功能方面并不具有顯著性。由于心肌梗死后，心臟微環境變化極易導致移植干細胞發生凋亡，干細胞生物學利用率受限，減弱了其對心肌梗死的治療療效。因此，提高干細胞移植后的存活率及功能發揮將為轉化醫學發展與心臟疾病的防治開拓新的方向與策略。

1 微小核糖核酸（miRNAs） 的生物學特性

miRNAs作為新一代調控細胞命運的決定因素，首次由Lee等[8]在秀麗線蟲體內發現，隨著對其結構及生理活性的研究發現：miRNAs是由長鏈初級核糖核酸（pri-miRNA）在細胞核內被核糖核酸酶Drosha剪切成具有莖環結構的miRNA前體（pre-miRNA）[9]。隨后pre-miRNA在轉運因子Exponin-5的作用下進入細胞質，在細胞質內被剪切成20～24 nt的雙鏈miRNAs,雙鏈miRNAs在特異性解旋酶作用下形成單鏈，從而成為成熟的miRNAs并在細胞質內表達其生理活性。 miRNAs的作用機制是通過結合到目標mRNA的 3'非編碼區（3'UTR），抑制靶標mRNA的翻譯從而起到重要的負性調控作用[10]。目前為止，在人類組織細胞中發現大約有2 000個miRNAs 參與調控人類總基因的30%～50%的表達[11]。研究還發現，在不同組織不同細胞miRNAs的表達譜及序列特征均有所不同，甚至細胞不同發育分化階段均會出現miRNAs的差異表達，起到調控細胞“定時、定向”分化的作用。且每個miRNAs可同時有多個靶基因位點，而每個靶基因位點可能同時受多個miRNAs調控,可見miRNAs種類繁多，其靶基因位點及功能作用復雜多樣。

2 miRNAs與干細胞功能相關性

雖然目前各種成體多能干細胞，胚胎干細胞，及誘導重組干細胞已成功用于治療缺血性心肌病并改善心梗后心功能[12]。然而干細胞移植治療心肌梗死仍處于初級階段，在臨床試驗及動物模型實驗的長期觀察中發現： （1）各種類型干細胞均存在移植存活率低的問題，尤其是從衰老機體或疾病狀態下獲取的干細胞，其存活及功能障礙更為明顯； （2）心肌梗死后移植干細胞募集到梗死區及與原位細胞長期整合作用在目前的大多數研究均未見成效[13]； （3）移植干細胞分化而來的功能心肌細胞十分有限，是否能夠在體內長期維持，疾病及衰老狀態是否影響其心源性分化潛能目前均尚未得知。因此，現已采取多種措施改善移植干細胞命運及功能，提高其修復梗死心肌的有效性。由于miRNAs參與調控基因表達網絡并具有容易被小分子干擾等特性，因此可用于干細的胞移植前處理。近年來，隨著對miRNAs與干細胞的研究發現， 在多種干細胞中均存在各自特異的miRNAs表達，對干細胞的生物學活動具有重要的調控作用。以往研究顯示幾種miRNAs家族成員可維持胚胎干細胞的多能性，并且將不同的miRNAs聯合過表達就足以誘導多能干細胞的產生；而一些miRNAs

可部分抑制維持干細胞未分化狀態基因的表達，并激活干細胞譜系特異性基因，發揮促進干細胞分化作用[14，15]，此外，干細胞所釋放的外泌體含有促進受損心肌組織修復的miRNAs。因此，干細胞的功能與miRNAs調控存在相關性。事實上，在心血管疾病的發生發展過程中，不同的miRNAs產生差異性表達，逆轉差異表達的miRNAs可能使冠脈疾病患者的細胞功能發生改變[16，17]

2.1 miRNAs促進移植干細胞存活

心肌損傷后釋放一系列炎癥因子及細胞因子，致使心臟微環境發生變化，極大影響了干細胞的存活，限制了移植細胞的功能發揮。近來的多項研究表明多種miRNAs家族成員可促進心肌梗死后移植細胞存活。 Huang等[18]報道在小鼠心肌梗死模型中，將過表達miRNA-126的骨髓間充質干細胞移植到心肌梗死區域，可促進新生血管形成，修復梗死心肌。另有報道稱，過表達miRNA-21的骨髓間充質干細胞，可通過改善線粒體膜電位損傷從而促進缺血缺氧條件下骨髓間充質干細胞的存活[19]。隨后Hu等[20]的研究顯示，將分別攜帶miRNA-21、miRNA-24、miRNA-221的大鼠心臟干細胞在體外模擬的氧化應激環境下凋亡減少，更有趣的是，同時過表達這三種miRNAs比單獨作用的抗凋亡能力強，其作用機制可能是與凋亡相關蛋白Bim結合，抑制其表達，從而發揮促細胞存活作用。此外，過表達miRNA-155可通過抑制受體相互作用蛋白1（RIP1），進而激活蘇氨酸激酶（AKT）信號通路，促進氧化應激環境中心臟干細胞存活[21]。由此可見，miRNAs可增強移植干細胞抵御心梗局部缺血缺氧微環境的能力，為干細胞發揮生物學效應奠定基礎。

2.2 miRNAs與干細胞遷移

miRNAs不但能夠促進移植干細胞存活，一些miRNAs還參與調控移植干細胞的遷移作用。基質衍生因子-1（SDF-1）是CXC族趨化因子成員，可與其受體CXCR4相互作用，對干細胞遷移起關鍵作用。近年來研究顯示：miRNA-150與miRNA-146其中一個靶mRNA即為CXCR4，兩者均可阻斷干細胞膜表面受體CXCR4翻譯過程，使SDF-1不能有效激活CXCR4及其下游信號通路，削弱移植細胞遷移作用[22，23]。因此抑制這兩種miRNAs的表達可促進移植干細胞遷移至心梗區域，發揮修復梗死心肌作用。然而有報道稱miRNA-150和miNA-146可與多種凋亡相關蛋白結合，其高表達可對細胞存活作用產生積極的影響。MiRNAs對于生物體的調控作用是復雜多樣的，利用miRNAs治療疾病的過程中，需要權衡利弊。

2.3 miRNAs促進干細胞分化

心肌缺血后再生壞死心肌細胞，建立有效的血運系統對保護心臟功能、改善遠期預后起關鍵作用。若只有新生心肌，則會由于持續缺血而不能改善心功能；若只有新生血管而無新生心肌，則不能產生收縮壓力。干細胞向心肌分化的過程是由一系列轉錄因子構成的信號網絡通路調控，參與該過程的miRNAs可對干細胞分化的各個環節進行微調。可促進移植干細胞分化為心肌細胞及促進血管新生，修復壞死心肌組織。

miRNA-1是高度保守的miRNAs家族，也是迄今為止研究最為廣泛的miRNAs之一。miRNA-1是肌特異性miRNA，在胚胎干細胞體外擬分化為胚體的過程中，miRNA-1可加強其中胚層基因的表達，使其向心肌方向分化。Fu等[24]發現過表達miRNA-1不僅能夠促進胚胎干細胞分化為心肌細胞，還能促進分化而來的心肌細胞的電生理成熟。隨后也繼之報道過骨髓間充質干細胞轉染miRNA-1后，可通過抑制Notch信號通路的下游轉錄因子Hes-1而發揮促進骨髓間充質干細胞分化為心肌細胞的作用[25]。Sluijter等[26]研究認為miRNA-1可通過下調組蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）表達而促進人心臟前體細胞向心肌細胞分化。此外，Richart 等[27]將胚胎源性心臟干細胞（SSEA1+/MESP1+）移植到小鼠心肌梗死區域，可顯著促進新生血管形成，而在該類型心臟干細胞中miRNA-21高表達，可以認為miRNA-21可促進心臟干細胞的血管新生作用。

2.4 miRNAs與干細胞旁分泌效應

大量研究證實心肌受損后移植干細胞可通過直接分化作用改善心功能，但是由于干細胞分化的心肌細胞數量有限，不足以替補心臟受損丟失的細胞數量，因此，不能單純用直接分化機制解釋干細胞再生修復受損心肌的作用。有學者認為干細胞不但可以直接再生心肌組織，而且還能通過旁分泌效應。增加細胞因子的表達，促進血管再生[28]。并有報道稱干細胞的旁分泌效應大于干細胞的直接分化作用[29]。

對干細胞旁分泌作用的最新研究發現，多種干細胞可釋放一種納米級膜性小囊泡，稱為外泌體，對細胞之間的相互作用至關重要。現已發現的外泌體中包含了相關miRNAs達764種。這些源于外泌體的 miRNAs在調控干細胞分化（let-7，即miRNAs成員之一）、胚胎發育和器官發生（miRNA-1）、腫瘤發生（miRNA-17-18/-19/19b）等生理和病理生理過程中發揮著關鍵作用[30，31]。Chen等[32]發現，心肌祖細胞的外泌體中富含miRNA-451，將心肌細胞與含該外泌體的培養基中共培養時發現，心肌細胞內的miRNA-451含量增加，且細胞對缺氧的耐受增強，由此證明心肌細胞可以內化心臟祖細胞釋放的外泌體，并利用miRNA-451啟動細胞內信號通路而減少缺血再灌注心肌細胞的凋亡，促進損傷細胞的修復。

3 面臨的問題及展望

目前干細胞介導治療心肌梗死面臨著移植存活率低[33]，作用機制不確定性等問題 ，但干細胞的臨床應用前景仍然擁有非常巨大的研究價值。miRNAs作為轉錄調控的關鍵分子，對干細胞的生物學功能起著至關重要的調節作用。近年來大量關于miRNAs改善干細胞療效的試驗研究取得可喜成果，但仍存在許多問題。首先，盡管miRNAs的抑制靶基因表達的作用非常強，但若需要過表達或抑制相關miRNAs需要實施轉基因實驗，即建立有效的小分子或病毒作為載體。雖然近年來利用轉基因技術治療疾病已受到很大關注，歐洲國家亦批準了第一個基因療法，并且以病毒作為載體治療心臟病的基因療法被證實是安全有效的[34，35]。然而大規模的臨床應用還需要經過一個漫長的階段。其次， miRNAs的生物學功能還遠遠未能被人類所了解，作為一種普遍存在的調控分子，后續研究將會發現更多的miRNAs，進一步闡明其靶基因位點和功能，以便確定對整個基因網絡的全面影響是亟待解決的問題。最后，目前對miRNAs靶基因的預測多是通過生物信息軟件來完成，因此仍需進行充分的生物學實驗來證實。

盡管應用miRNAs調控干細胞生物學功能面臨諸多挑戰，但它對改善干細胞治療缺血性心肌病的作用是有目共睹的，相信隨著研究的進一步深入，上訴問題均會得以解決，

對miRNAs的了解也必將越來越全面和準確，這將為生命科學研究和臨床應用miRNAs介導干細胞治心肌梗死開啟新的時代。

[1] van der Bogt KE, Sheikh AY, Schrepfer S. et al. Comparison of different adult stem cell types for treatment of myocardial ischemia. Circulation, 2008, 118: S121-S129.

[2] Janssens S, Dubois C, Bogaert J, et al. Autologous bone marrowderived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. Lancet, 2006, 367: 113-121.

[3] Hare JM, Traverse JH, Henry TD, et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells（ prochymal ）after acute myocardial infarction. J Am Coil Cardiol, 2009, 54: 2277-2286.

[4] Ellison GM, Vicinanza C, Smith AJ, et al. Adult c-kitpos cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and Repair. Cell, 2013, 8: 827-842.

[5] Chugh AR, Beache GM, Loughran JH, et al. Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy: the SCIPIO trial: surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance. Circulation, 2012, 126: S54-S64.

[6] Bolli R, Chugh AR, D’Amario D, et al. Cardiac stem cells in patients withischaemic cardiomyopathy （SCIPIO）: initial results of a randomised phasetrial. Lancet, 2011, 378: 1847-1857.

[7] van Berlo JH, Kanisicak O, Maillet M, et al. c-kit+cells minimally contrib cardiomyocytes to the heart. Nature, 2014, 509: 337-345.

[8] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V, et al . The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75: 843-854.

[9] Huntzinger E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet, 2011, 12: 99-110.

[10] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, 116: 281-297.

[11] Iorio MV, Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med, 2012, 4: 143-159.

[12] Segers VF, Lee RT. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature, 2008, 451: 937-942.

[13] Chavakis E, Dimmeler S. Homing of progenitor cells to ischemic tissues. Antioxid Redox Sign, 2011, 15: 967-980.

[14] Heinrich EM, Dimmeler S. MicroRNAs and stem cells: control of pluripotency, reprogramming, and lineage commitment. Circ Res, 2012, 110: 1014-1022.

[15] Leonardo TR, Schultheisz HL, Loring JF, et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol, 2012, 14: 1114-1121.

[16] Jakob P, Doerries C, Briand S, et al. Loss of angiomiR-126 and 130a in angiogenic early outgrowth cells from patients with chronic heart failure: role for impaired in vivo neovascularization and cardiac repair capacity. Circulation, 2012, 126: 2962-2975.

[17] 陸永光, 李浪.微小核糖核酸與冠心病關系的研究進展.中國循環雜志, 2010, 25: 484-486.

[18] Huang F, Zhu X, Hu XQ, et al. Mesenchymal stem cells modified with miR-126 release angiogenic factors and activate Notch ligand Deltalike-4, enhancing ischemic angiogenesis and cell survival. Int J Mol Med, 2013, 31: 484-492.

[19] Nie Y, Han BM, Liu XB. et al. Identification of microRNAs involved in hypoxia- and serum deprivationInduced apoptosis in mesenchymal stem cells . Int J Biol Sci, 2011, 7: 762-768.

[20] Hu S, Huang M, Nguyen PK, et al. Novel microRNA prosurvival cocktail for improving engraftment and function of cardiac progenitor cell transplantation. Circulation, 2011, 124: S27-S34.

[21] Liu J, van Mil A, Vrijsen K, et al. MicroRNA-155 prevents necrotic cell death in human cardiomyocyte progenitor cells via targeting RIP1. J Cell Mol Med, 2011, 15: 1474-1482.

[22] Tano N, Kim HW, Ashraf M. et al. microRNA-150 regulates mobilization and migration of bone marrow-derived mononuclear cells by targeting Cxcr4. PLoS One, 2011, 6: 2311-2314.

[23] Labbaye C, Spinello I, Quaranta MT, et al. A three-step pathway comprising PLZF/miR-146a/CXCR4controls megakaryopoiesis. Nat Cell Biol, 2008, 10: 788-801.

[24] Fu JD, Rushing SN, Lieu DK. et al. Distinct roles of microRNA-1 and -499 in ventricular specification and functional maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One, 2011, 6: 2741-2747.

[25] Huang F, Tang L, Fang ZF, et a1.MiR-1 medited induction of eardiogenesis in mesenehymal stem cells via downregulation of hes-1. Biomed Res Int, 2013, 10: 216-286.

[26] Sluijter JP, van Mil A, van Vliet P, et a1.MicroRNA-1 and MicroRNA -499 regulate differentiation and proliferation in human_ derived eardiomyocyte pmgenitor cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30: 859-868.

[27] Richart A, Loyer X, Howangyin K, et al. MicroRNA-21coordinates human multipotent cardiovascular progenitors therapeutic potential. Stem Cells, 2014, 32: 2908-2922.

[28] Chimenti I, Smith RR, Li TS, et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res, 2010, 106: 971-980.

[29] Chimenti I, Smith RR, Leppo MK, et al. Human cardiac progenitor cells secrete paracrine factors in vitro and in vivo. J Mol Cell Cardiol, 2008, 44: 802-803.

[30] Mathivanan S, Fahner CJ, Reid GE, et al. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RAN and lipids . Nucleic Acids Res, 2012, 40: 1241-1244.

[31] Waldenstrom A, Genneback N, Hellman U, et al. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PLoS One, 2012, 7: 1024-1032.

[32] Chen L, Wang Y, Pan Y, et al. Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemiac myocardium from acute ischemia/reperfusion injury. BBRC, 2013, 431: 566-571.

[33] 李玲, 石蓓. 心臟干細胞移植治療缺血性心臟病的研究進展. 中國循環雜志, 2015, 30: 291-292.

[34] Büning H. Gene therapy enters the pharma market: the short story of a long journey. EMBO Mol Med, 2013, 5: 1-3.

[35] Shah SJ, Wasserstrom JA. SERCA2 a gene therapy for the prevention of sudden cardiac death: a future theranostic for heart failure? Circulation, 2012, 126: 2047-2050.

2015-04-16）

（編輯：王寶茹）

563003 貴州省遵義市，遵義醫學院附屬醫院 心內科

王艷 碩士研究生 主要從事干細胞移植治療心肌梗死研究 Email:1321246876@qq.com 通訊作者：石蓓 Email:shibei2147@163.com

R54

A

1000-3614（2015）09-0916-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.022