Toll 樣受體與類風濕關節炎相關性研究進展①

姚茹冰 王圓圓 蔡 輝 (南京軍區南京總醫院中西醫結合科/風濕免疫專科，南京 210002)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關節滑膜炎為特征的慢性、全身性、自身免疫性疾病。近年的研究提示，Toll 樣受體(Toll like receptor，TLR)不僅在固有免疫中具有重要作用，也是聯系固有免疫與適應性免疫的橋梁，而且從多方面影響適應性免疫應答，在RA 發病機制中可能有重要的作用。本文就Toll 樣受體與RA 相關性的研究進展，進行綜述。

1 TLR 信號通路

TLR 蛋白家族最早在果蠅體內發現，是免疫系統中最原始的組成要素之一。TLR 是進化高度保守的跨膜蛋白，目前在人類已鑒定出13 種TLR(TLR1～TLR13)，分布在相關的免疫細胞及免疫效應細胞表面［1］。

TLR 是Ⅰ型膜受體，胞內區(羧基端)約含200個氨基酸殘基，結構保守，胞外區(氨基端)含18～31 個富含亮氨酸的重復序列。不同TLR 的胞外區氨基酸組成的差異較大，決定了它們各自有其特異性的配體。TLR 是一類重要的模式識別受體，每種受體通過特定識別來源于病毒、細菌和真菌等“病原體相關模式分子”(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，察覺微生物感染的存在，激發機體免疫反應。同時，TLR 識別一些宿主衍生分子降解產物，即“損傷相關模式分子”(Danger associated molecular patterns，DAMPs)，主要包括細胞壞死后釋放的細胞內分子如熱休克蛋白、核高遷移率族1，細胞外基質分子如多功能蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖維蛋白原和腱糖蛋白-C 等，以及細胞外基質的低分子量片段如透明質酸、肝素等。不同的TLR 可特異性識別不同的PAMPs 和DAMPs。如TLR4 識別細菌脂多糖(LPS)，TLR5 識別鞭毛，TLR9 識別非甲基化細菌DNA，TLR3、7、8 可分別與病毒核酸結合。其亞型的定位也與其病原配體相對應，TLR1、2、4、5、6 在細胞表面表達，TLR3、7、8、9 主要在細胞內涵體內。細胞表面TLR 識別蛋白多糖、脂肪酸，內涵體TLR 識別內源性核酸，在非感染性組織損傷時，DAMPs 可激活TLR，導致下游信號傳導興奮，轉錄因子移位至細胞核，促炎介質上調，引起了持續性炎癥反應，形成惡性炎癥循環。

TLR 的生物學效應主要由髓樣分化反應蛋白88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴型和非MyD88 依賴型傳導途徑介導［2］。MyD88 是一種接頭分子，除了TLR3，MyD88 與其他所有TLR相關。TLR1、2、4、6 需要額外蛋白(TRIF)來與MyD88 相結合，而TLR5、7、9 可與MyD88 直接結合。一般來說，激活MyD88 依賴途徑可引起白介素1 受體相關激酶(IRAK)、泛素連接酶6(TRAF-6)、TANK 結合激酶1(TBK1)蛋白、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)和轉錄因子NF-κB 等信號介質的激活，激活NF-κB 可引起各種促炎癥因子如TNF-α、IL-6、趨化因子等表達增加。刺激MyD88 非依賴TRIF 途徑可引起轉錄因子干擾素調節因子(IRF)蛋白和干擾素的活化，募集IRF-3 到各自的DNA 結合位點啟動轉錄產生干擾素及其協同刺激分子。

2 TLR 生物學功能

TLR 在固有免疫及適應性免疫應答中均發揮重要作用。固有免疫中，TLR 在識別病原微生物的基礎上直接觸發胞內殺菌機制或者誘導免疫炎性因子產生以擴大非特異性防御。適應性免疫應答中，TLR 能誘導樹突狀細胞成熟，激活其分泌細胞因子及趨化因子，并誘導其表達共刺激分子;TLR 對Th1和Th2 細胞的分化和功能平衡有顯著的影響;TLR可以誘導調節性T 細胞的活化。此外，TLR 還參與幼稚B 細胞的激活，影響記憶T 細胞反應的強度和質量，啟動CD8+T 細胞對抗可溶性蛋白抗原的反應等等，TLR 廣泛參與特異性免疫反應的各種途徑，參與慢性免疫性炎癥疾病的發生發展。

3 TLR 在RA 的表達及作用

研究提示，RA 患者外周血單個核細胞、滑膜組織、滑液、滑膜巨噬細胞及滑膜成纖維細胞均存在TLRs 表達增加，且TLR2、3、4、5、7、8 及9 等可能不同程度參與了RA 發病。

李通等［3］研究顯示活動期RA 患者外周血單核細胞TLR2 表達增高，且TLR2 的表達與疾病活動指標如DAS、血清C 反應蛋白及血沉密切相關。活動期RA 患者存在著固有免疫系統的活化，TLR2 的高表達可能促進了外周血單核細胞的活化。RA 患者血單核細胞TLR2 的表達與胰島素抵抗有密切的關系［4］。阻斷TLR2 可阻止RA 體外滑膜移植培養物自發的細胞因子釋放，提示靶向TLR2 在治療RA 中可能有重要作用［5］。TLR3 通過上調RA 患者滑膜成纖維細胞核因子κB 受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表達促進破骨細胞形成［6］。激活TLR3 誘導RA 滑膜成纖維細胞分泌血管內皮生長因子和IL-8，這個過程被NF-κB 信號途徑中介，靶向TLR3 路徑可能是一個有前景的預防RA 病理性血管生成的方法［7］。錢雷等［8］的研究提示RA 患者外周血單核細胞的TLR4 表達及對脂多糖刺激的反應性增加，且該細胞具有較強的誘導Th17 細胞分化能力。Th17 細胞及其分泌的IL-17 等細胞因子在RA 的滑膜炎、軟骨破壞及骨侵蝕骨破壞中有重要的作用。郭慧芳等［9］研究顯示，RA 患者外周血單核細胞具有合成和分泌高遷移率族蛋白(HMGB)1 蛋白的功能，并部分通過與TLR4 結合激活炎癥反應，加重骨質破壞。任敏等［10］研究顯示，TLR4 在RA 患者外周血CD14+單核細胞表面表達上調且與血清IL-18 的水平呈正相關，而與DAS28 呈負相關，提示TLR4 可能間接參與RA 的發病過程。RA 的滑膜巨噬細胞和外周血單核細胞TLR5 表達增加，RA 單核細胞中的TLR5 對RA 滑液中的TNF-α 有重要的調節作用，且其表達與RA 疾病的活動性及TNF-α 水平高度相關［11］。TLR5 可能通過直接吸引內皮細胞或間接促進Th17 細胞生長調節RA 的血管增生，在血管發生中有新奇的作用，可能是RA 一個有希望的新靶標［12］。RA 滑膜組織有TLR7 及TLR8 表達，且TLR7 在RA 單核細胞表達與DAS28 評分和TNF-α水平密切相關，RA 滑液中的ssRNA 可以作為TLR7的內源性配體介導TNF-α 轉錄［13］。有研究提示TLR9 可能參與了骨髓B 細胞的直接激活和增殖，在RA 的發病中發揮作用［14］。

4 RA 的TLRs 配體

4.1 微生物配體 早期的研究顯示，在RA 患者關節中發現細菌及病毒DNA，推測PAMPs 激活TLRs可能引起疾病的發生。TLR2 配體細菌肽多糖，誘導RA 滑液成纖維細胞表達IL-6 及CXCL8。TLR3 配體polyI:C 誘導滑液成纖維細胞表達IL-1βmRNA。RA 外周血單核細胞對TLR4 配體LPS 反應增強。從RA 患者滑液分離的巨噬細胞，對肽聚糖和LPS反應增強，TLR2 及TLR4 表達增加。

4.2 內源性配體 內源性配體的存在表明即使沒有感染存在，受損處及處于應激狀態的細胞發出的信號也可以引發免疫應答，參與免疫性疾病的發生發展。許多研究顯示，RA 關節組織中存在內源性TLRs 配體，主要是TLR4 和TLR2 激動因子，這些因子包括熱休克蛋白、纖維蛋白原、纖維連接蛋白EDA 等，提示TLR 通過識別某些PAMPs 參與了慢性炎癥性關節炎的發生和發展。有研究提示，壞死的滑液細胞依賴TLR3 途徑增加了CXCL10、CCL5和IL-6 的表達，壞死的滑液細胞釋放的RNA 可能作為TLR3 的內源性配體刺激滑膜成纖維細胞促炎癥反應基因的表達。TLR4 拮抗劑可抑制體內滑膜組織培養物自發分泌TNF-α 和IL-1β;當抑制MyD88 和Mal/TIRAP 時，可抑制RA 滑膜組織自發分泌炎性細胞因子，均提示RA 滑膜組織有內源性TLR 配體。研究顯示，壓力反應蛋白gp96 主要通過TLR2 激活正常巨噬細胞，而且，gp96 激活RA 滑膜巨噬細胞明顯高于對照的巨噬細胞。gp96 誘導巨噬細胞TLR2 表達，支持gp96 作為一個內源性TLR配體在RA 發病機制中發揮作用［15］。HMGB1 通過上調RA 患者CD14+單核細胞TLR2 和IL-23 表達，促進Th17 細胞分化［16］。Snapin 作為RA 中TLR2一個新的內源性配體，在RA 滑膜高表達［17］。

5 干預TLRs 靶向治療RA

TLRs 在RA 發病機制中起重要作用，為RA 的治療提供了新的靶點。如可溶性假性受體和中和抗體可阻斷受體/配體結合，從而抑制炎癥反應的發生;抑制內源性因子釋放和阻斷TLRs 表達也均是RA 的治療手段;受體二聚化是TLRs 激活的前提條件，因此阻斷其二聚化也是一種治療策略;TLRs 信號下游的信號介導蛋白質分子也可是治療靶點。

Opsona 公司開發了抗TLR2 抗體，一種是OPN-305，阻止細胞因子的釋放，另一種是OPN-301，它可有效地抑制人RA 體外培養物自發性分泌細胞因子，并可作為TNF-α 抗體［18］。NovImmune 公司開發的單克隆抗體NI0101/α 能夠抑制TLR4 的激活。小分子如米安色林和咪喹莫特可抑制人類RA 滑膜組織分泌TNF-α，前者抑制TLR3、7、8、9，后者抑制TLR8［19］。蘿卜硫素、OSL07 及烷酮衍生物可防止TLR4 二聚化并抑制TLR4 下游信號的激活［20］。

6 展望

綜上所述，TLR 在RA 的發生發展中可能發揮重要的作用，但是對于其具體的作用機制仍有待進一步研究。如同一種TLR 活化后對不同效應細胞的作用，多種TLR 共同激活的效應及TLR 多態性對疾病的影響等還不十分清楚，明確這些內容，不僅可從新的角度認識RA 等自身免疫性疾病，更重要的是為尋找新的預防和治療RA 的方法提供理論基礎。

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