基于iTRAQ技術的蛋白質組學應用于慢性腎臟病研究的進展

宋業旭，贠捷，馬曉鵬，裴春鵬，金麗霞，趙大鵬，馬艷春，宋立群

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

·綜述·

基于iTRAQ技術的蛋白質組學應用于慢性腎臟病研究的進展

宋業旭1，贠捷2，馬曉鵬2，裴春鵬2，金麗霞2，趙大鵬2，馬艷春1，宋立群2

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

自1994年蛋白質組學的概念被提出以來，蛋白質組學已經應用在生命科學和醫學的各個領域，并成為“后基因時代”的研究熱點。蛋白質作為生物功能的具體執行者，對其的表達水平、翻譯后修飾、轉運定位、蛋白質之間相互作用及蛋白與其他生物分子相互作用的研究，可以獲得蛋白質水平上的對疾病發生機制、臨床診斷、藥物治療機制等方面的認識[1-2]。

1 蛋白質組學技術

對蛋白質進行研究的主要內容是蛋白質的分離、鑒定和定量研究。對蛋白質的定性研究常用的是蛋白質質譜鑒定(如MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS)和Shotgun混合蛋白質鑒定。對蛋白質定量研究包括凝膠路線(如2D雙向凝膠電泳和DIGE熒光差異雙向凝膠電泳)、質譜路線(如Label free非標記質譜定量、iTRAQ質譜定量、SILAC質譜定量、SRM /MRM目標蛋白絕對定量)。對蛋白質修飾分析常用技術如修飾肽段富集LC-MS/MS。

2 相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)技術原理

2004年美國應用生物系統公司推出一項新的體外同位素標記技術，即iTRAQ。iTRAQ試劑分為4標和8標兩種，其原理是采用與氨基反應等量的異位標簽，通過與多臺氨基基團共價反應而達到標記的作用。以8標試劑為例，其標簽分子量為145，由報道基團(相對分子量分別為121、119、118、117、116、115、114、113)、質量平衡臂(質量分別為24、26、27、28、29、30、31、32)和一個相同的多肽反應基團組成。因此在進行質譜鑒定時，標記后第一級質譜檢測時，其分子量完全相同。進行第二級質譜分析時，不同同位素標簽可產生不同信號離子。通過蛋白質序列數據庫搜索標記后多肽肽鍵斷裂所產生的離子串，可確定蛋白質前體組成，并通過測定信號離子豐度檢測樣本中蛋白豐度。

3 iTRAQ技術的優勢

盡管傳統的雙向凝膠電泳(2-DE)方法應用比較廣泛，但雙向電泳本身的局限性，比如疏水性蛋白和膜蛋白難以溶解，低豐度蛋白受到高豐度蛋白的影響，極酸或及極堿性蛋白受到一維固相pH梯度等電聚焦和電滲流等問題的影響，小分子量蛋白可能與有力的十二烷基磺酸鈉離子對流混合，故難以檢測出疏水性蛋白、膜蛋白、低豐度蛋白、極性蛋白、小分子量蛋白等。

iTRAQ試劑最多可同時對8組樣品的蛋白進行定量的蛋白質組學研究，提高了組間分析的準確性。iTRAQ的標記機制對蛋白質翻譯后修飾位點沒有影響，可達到對蛋白質翻譯后修飾如磷酸化、泛素化等方面研究的要求。最重要的是iTRAQ所需樣本來源廣泛，細胞、組織、血漿、血清、尿液，甚至唾液、腦脊液、淚液、鼻分泌物等均可作為檢測樣本，便于篩選臨床診斷指標的研究。

有研究[3-4]分別用2-DE分離差異蛋白點和iTRAQ標記樣本后使用MALD ITOF/TOF串聯飛行質譜對背根神經節細胞進行蛋白的鑒定，結果顯示2-DE方法分離出4種差異蛋白，而iTRAQ技術發現22中蛋白的變化，其中2-DE鑒定出的4種上調蛋白為結構蛋白和信號轉導蛋白，且蛋白量的變化都在2倍以上，而iTRAQ技術鑒定的22中上調蛋白為結構蛋白、信號蛋白、代謝蛋白、降解蛋白、細胞基質蛋白等，蛋白變化在1.3～1.6之間。說明iTRAQ技術在鑒定和比較總蛋白的數量和種類上有明顯的優勢。Wu等[4]通過比較DIGE、ICAT及iTRAQ三種蛋白定量方法研究已知蛋白混合物，結果發現三種方法都能對蛋白混合物準確定量，但iTRAQ是最敏感的定量方法。

4 iTRAQ技術在腎臟疾病方面的應用

目前iTRAQ在腎臟疾病方面的應用主要集中在尋找臨床診斷標記物方面。Overgaard等[5]將123名1型糖尿病患者按尿蛋白量分成三組，分別為無蛋白尿組、微量蛋白尿組(尿微量蛋白在30～300 mg/24 h)、大量蛋白尿即糖尿病腎病組(尿微量蛋白大于300 mg/24 h)。將三組患者血清樣本混合成三份樣本，并用iTRAQ試劑標記，納升液相色譜儀進行蛋白質鑒定，通過Proteome Discoverer軟件處理數據，IPA軟件分析蛋白質功能通路。實驗鑒定出112個差異蛋白，通過研究差異蛋白之間的關系，認為糖尿病腎病的進展和心血管并發癥的發生與脂蛋白A2、B、C3、D和E關系密切，并通過多重免疫分析方法選取糖尿病腎病快速進展和緩慢進展的患者對iTRAQ結果進行驗證，認為所發現的差異蛋白中可能作為對糖尿病腎病的早期診斷和預后的生物標記物。王玉等[6]通過iTRAQ標記的二維液相色譜與串聯質譜連用技術檢測臨床患者尿液蛋白質組學，并比較以腎病綜合征為主要表現的30例患者的尿液。按其病理改變不同分為兩組，15例為膜性腎病組，15例為局灶節段性腎小球硬化組，隨機將組內每5人尿液合為一個樣本并清除白蛋白/IgG抗體，在總共6組樣品中共鑒定出809個蛋白，其中豐度排名前十位的蛋白涉及代謝、細胞活動、發育調控、免疫刺激反應等多個方面，差異蛋白共鑒定出16個，涉及纖溶、免疫反應、代謝、細胞增生等過程。有研究[7-9]結合iTRAQ標記并采用高效液相-四級桿飛行時間串聯質譜技術分析三例病理診斷為V型狼瘡性腎炎患者腎組織，并與正常組(1例為腎腫瘤患者遠離病灶的正常腎組織和2例非腎性血尿患者腎組織)相對比，共鑒定出512個蛋白，篩選出18個顯著差異蛋白，認為其差異蛋白質的主要功能是激酶和氧化還原酶。

5 展望

使用iTRAQ標記的腎臟蛋白質組學方面的研究還處于起步階段。iTRAQ結合多維液相色譜和串聯質譜技術也有一定的局限性，比如iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中所有蛋白質相結合，易受樣本中雜質蛋白污染，所得的數據需要復雜的生物信息學工具才能進行分析，而且每次實驗都必須鑒別全部的蛋白質組。當前iTRAQ在腎臟疾病方面的應用主要集中在尋找臨床診斷標記物方面，對藥物作用靶點、疾病機制等方面的應用尚不完善，因此，隨著蛋白質組學的深入研究，相信應用iTRAQ技術必將為了解蛋白質在腎臟疾病中的作用做出積極的貢獻。

[1] Ross PL,Huang YN,Marchese JN,et al.Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[J].Mol & cell prot,2004,3(12):1154-1169.

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[4] Wu WW,Wang G,Baek SJ,et al.Comparative study of three proteomic quantitative methods,DIGE,cICAT,and iTRAQ,using 2D gel-or LC-MALDI TOF/TOF[J].JPR,2006,5(3):651-658.

[5] Overgaard AJ,Thingholm TE,Larsen MR,et al.Quantitative iTRAQ-based proteomic identification of candidate biomarkers for diabetic nephropathy in plasma of type 1 diabetic patients[J].Clin Prot,2010,6(4):105-114.

[6] 王玉,孫偉,左科,等.腎小球疾病患者尿液比較蛋白質組學研究方法的建立[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2014,23(2):140-145.

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[9] DeSouza L,Diehl G,Rodrigues M J,et al.Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].JPR,2005,4(2):377-386.

國家自然科學基金資助(81273911)

宋業旭，博士，研究實習員，Email:leaf615@sina.com

宋立群，教授，博士生導師，Email:qunli@sina.com

R692

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10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.033

2015-03-10)