S100A12在重癥急性胰腺炎治療中的潛在作用

張峰，詹銀楚，姜仁鴉，方劍，姜繼華

急性胰腺炎是胰腺最常見的病變，其發(fā)病率可達(dá)到百分之八，并呈逐年上升的趨勢[1]。輕型急性胰腺炎是一種自限性疾病，預(yù)后較好，但有約25%的患者表現(xiàn)為重癥急性胰腺炎，病死率高達(dá)10%～30%[2-3]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)S100A12在許多疾病中，如心血管疾病[4-5]、炎癥性腸病[6]、急慢性肺部疾病[7]、阿爾茨海默病[8]、腎小球腎炎[9]、II型糖尿病[10]、風(fēng)濕性疾病[11]、川崎病[12]等中均發(fā)現(xiàn)S100A12呈特異性高表達(dá)狀態(tài)，并在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)已有多項研究證明，S100A12不是管家蛋白，而是在不同細(xì)胞種類、細(xì)胞周期及狀態(tài)下選擇性表達(dá)的，與炎癥反應(yīng)有著十分緊密的聯(lián)系。

S100A12是S100蛋白家族中的成員之一[13]。S100A12基因定位于人類染色體1q21，介于S100A8和S100A9之間，其編碼的鈣結(jié)合蛋白S100A12以共價二聚體的形式存在。目前研究發(fā)現(xiàn)S100A12擁有兩個Ca2+結(jié)合位點—C端和N端。這兩個位點也是S100A12區(qū)別于其他S100家族成員的重要依據(jù)[14]。當(dāng)S100A12在與Ca2+結(jié)合或受到其他炎癥介質(zhì)刺激而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化時，目標(biāo)蛋白結(jié)合位點就會暴露，S100A12再通過結(jié)合相應(yīng)的配體，從而發(fā)揮其功能。因此，通過阻斷S100A12與其相應(yīng)的配體的結(jié)合，如使用S100A12重組抗體抑制S100A12功能，可能會為重癥急性胰腺炎的治療提供一種新的策略。本研究通過建立小鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察、探討S100A12在小鼠重癥急性胰腺炎治療中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性ICR小鼠160只，體重（21.26±0.93）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。在適宜溫度、濕度和光照條件下于動物實驗中心常規(guī)飼養(yǎng)一周，實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.2 主要試劑

雨蛙素（Caerulein，Cn）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購于Sigma公司，小鼠S100A12重組抗體購于Sino生物科技公司，小鼠S100A12酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于Elabscience生物科技有限公司，小鼠AMY ELISA試劑盒購于Cusabio生物科技有限公司，小鼠CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購于上海西唐生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

脫水機（STP120，MICROM公司）、包埋機（AP280-2，MICROM公司）、切片機（HM335E，MICROM公司）、顯微鏡（Nikon eclipse 80i，Nikon公司）、電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）（DS-Fi1，500萬象素，Nikon公司）、圖像分析軟件（Carl Zeiss Imaging Systems，Carl Zeiss公司）、低速自動平衡離心機（LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機廠）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供；孵育箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）、酶標(biāo)儀（WellscanMK-3，Labsystems Dragon公司）等由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室提供。

1.4 模型建立

將160只SPF級雌性ICR小鼠用完全隨機方法分成對照組[A組，體重（21.17±1.02）g]、輕型組[B組，（21.28±0.92）g]、重癥組[C組，（21.22±0.91）g]和干預(yù)組[D組，（21.37±0.91）g]，每組40只。小鼠在建模開始前12 h禁食，但不禁水。雨蛙素、脂多糖在開始建模前臨時配制[15-16]，其中A組小鼠的生理鹽水按照25 mg/kg經(jīng)腹腔注射，連續(xù)7次，每次間隔1 h；B組小鼠的雨蛙素按照50μg/kg經(jīng)腹腔注射，連續(xù)7次，每次間隔1 h；C組小鼠的雨蛙素按照50μg/kg經(jīng)腹腔注射，連續(xù)7次，每次間隔1 h，脂多糖按照10 mg/kg在首次雨蛙素注射5 h后經(jīng)腹腔注射；D組則在首次雨蛙素注射前30 min按照50μg/kg注射S100A12重組抗體，余同C組。

1.5 采血化驗

首次雨蛙素注射后8 h、12 h和24 h采血，采用眼眶取血法，接取適量置于2 mL EP管中，不抗凝，待血液凝集后，離心機3000 r/min離心5 min，收集上層血清，-20 ℃冰箱保存，待測各項指標(biāo)。

1.6 取材觀察

高濃度戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉致死，剖腹，取出小鼠胰腺組織，10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素和伊紅（HE）染色，光鏡觀察。胰腺病理學(xué)變化采用雙盲法按照Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[17]對其進行病理學(xué)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 胰腺病理學(xué)評分

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計處理。兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，數(shù)據(jù)用（±s）表示；多個實驗組與一個對照組間兩兩比較采用LSD檢驗、Dunnett檢驗，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用SNK法；分值等級差異用Ridit分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存率

A組、B組、D組無小鼠死亡，生存率均為100%；C組中有1只小鼠在實驗開始后約30 h死亡，生存率97.5%。

2.2 血清指標(biāo)測定

與A組相比，各時段B組和C組血清AMY、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α、S100A12（P＜0.05，P＜0.01），說明建立模型成功；與B組相比，各時段D組血清S100A12濃度降低（P＜0.05），而與C組相比，各時段D組血清中AMY、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯降低（P＜0.05），S100A12濃度顯著降低（P＜0.01），說明S100A12可能在監(jiān)測小鼠重癥急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展以及治療中起重要作用，見表2。

表2 不同時間點各組血清指標(biāo)變化情況（±s）

表2 不同時間點各組血清指標(biāo)變化情況（±s）

與A組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比，#P＜0.05；與C組比，△P＜0.05，△△P＜0.01

C組A組B組D組組別AMY（U/L）8h 12h 24h CRP（mg/L）8h 12h 24h IL-1β（pg/mL）8h 12h 24h IL-6（pg/mL）8h 12h 24h TNF-α（pg/mL）8h 12h 24h S100A12（pg/mL）8h 12h 24h 1161.2±364.01173.1±360.51160.9±342.93156.1±410.6*3592.7±489.1*2952.9±423.8*7353.2±485.1**8148.2±437.9**7119.2±470.8**2352.3±466.6△2724.1±420.8△2144.2±449.7△10.245±0.61410.183±0.66110.180±0.64915.820±0.680*17.862±0.761*13.926±0.759*21.440±0.865*25.261±0.982*19.285±0.969*14.594±0.710△13.648±0.712△12.680±0.716△10.611±1.89210.463±1.83610.516±1.821160.335±3.986**180.178±4.252**150.378±3.487**240.217±2.627*280.681±3.120*231.417±3.281*140.304±2.372△148.579±2.421△138.550±2.399△4.569±0.9974.581±1.0024.598±1.0049.491±1.236*21.707±1.313**16.747±1.432**50.863±1.351**59.914±1.146**55.367±1.240**41.869±1.428△36.775±1.456△31.499±1.377△66.764±4.45168.762±9.36866.353±8.539311.059±6.392**473.223±11.223**331.145±13.735**633.543±7.259**721.063±10.128**654.392±14.289**319.940±6.651△426.614±11.159△345.039±14.652△35.132±6.80034.966±6.49434.966±6.451343.714±7.610**591.451±20.609**464.947±19.527**1413.080±9.069**2393.831±33.564**1778.152±39.919**221.720±7.197**#△△166.902±11.298*#△△137.462±15.098*#△△

2.3 胰腺組織肉眼及光鏡觀察

肉眼見A組胰腺和胰外器官均基本正常；B組胰腺與周圍組織粘連，腺體腫脹，胞膜緊張，色澤蒼白，胰外器官無明顯異常變化；C組胰腺與周圍組織粘連嚴(yán)重，腺體腫脹，色澤灰暗，表面可見多處皂化斑點和出血點，大網(wǎng)膜、腸系膜等處出現(xiàn)少量皂化斑，肝臟色澤較暗，略顯腫脹；D組胰腺無明顯外觀異常，與周圍組織稍有粘連，胰外器官無明顯異常變化。光鏡下觀察A組胰腺間質(zhì)正常，小葉結(jié)構(gòu)完整，無出血、壞死改變（圖1A）；B組胰腺間質(zhì)充血水腫，有炎性細(xì)胞浸潤，可見少量局灶性腺泡壞死，輕微脂肪壞死，偶見出血（圖1B）；C組胰腺組織嚴(yán)重水腫，腺泡細(xì)胞分布相對獨立，猶如孤島，腺體細(xì)胞大量壞死，結(jié)構(gòu)模糊，局部呈融合性壞死，壞死區(qū)域有大量炎性細(xì)胞浸潤（圖1C）；D組胰腺輕微水腫，無空泡形成，有輕微脂肪細(xì)胞壞死，少見出血（圖1D）。

2.4 各組胰腺組織病理評分

圖1 光鏡下各組胰腺的病理變化，HE染色（圖A1、B1、C1、D1，×100；圖A2、B2、C2、D2，×400)

病理評分結(jié)果顯示：同A組相比，B組胰腺出現(xiàn)顯著的間質(zhì)水腫（P＜0.01）和輕中度的炎癥浸潤（P＜0.05），但沒有出現(xiàn)明顯實質(zhì)壞死和出血（P＞0.05），C組胰腺出現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)水腫、炎癥浸潤和實質(zhì)壞死，并出現(xiàn)不同程度的出血（P＜0.01），D組胰腺出現(xiàn)輕中度的間質(zhì)水腫和炎癥浸潤（P＜0.05），但沒有出現(xiàn)明顯實質(zhì)壞死和出血（P＞0.05）；同B組相比，C組胰腺的炎性浸潤、實質(zhì)壞死和出血要嚴(yán)重的多（P＜0.01），但D組胰腺的炎性浸潤情況相較于B組要有所好轉(zhuǎn)（P＜0.05）；同C組相比，D組胰腺的炎性浸潤、實質(zhì)壞死及實質(zhì)出血情況均要明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.01），見表3。

3 討論

重癥急性胰腺炎患者住院時間延長，治療費用巨大，給人類健康和社會經(jīng)濟構(gòu)成巨大威脅。而目前用來判斷急性胰腺炎嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)有Ranson評分、Glasgow評分、APACHEII評分、胰酶、胰蛋白酶原激活肽（TAP）等[18]，但這些評估方法對重癥胰腺炎早期診斷的敏感性、特異性均達(dá)不到臨床要求，而且還存在檢測復(fù)雜、費用高昂等局限性。有學(xué)者曾用垂盆草提取物來治療重癥急性胰腺炎及其引起的急性肺損傷取得良好效果，并通過病理發(fā)現(xiàn)治療后的動物胰腺組織中腺泡細(xì)胞腫脹情況和腺泡細(xì)胞間炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減輕[19]，但目前對垂盆草提取物的具體成分，特別是有效成分尚未完全弄清。因此，尋找新的、和急性胰腺炎嚴(yán)重密切相關(guān)并能夠在臨床推廣應(yīng)用的炎性因子并加以調(diào)控或許能使急性胰腺炎的治療產(chǎn)生突破性進展。

通過實驗我們發(fā)現(xiàn)：輕型胰腺炎組的小鼠血清S100A12濃度就已經(jīng)開始升高，重癥急性胰腺炎小鼠的血清S100A12濃度更是明顯升高，通過干預(yù)抑制S100A12功能，小鼠胰腺的炎癥浸潤、實質(zhì)壞死及實質(zhì)出血情況相較于重癥胰腺炎組的小鼠均要明顯好轉(zhuǎn)，甚至相比于輕型胰腺炎組，干預(yù)組中小鼠胰腺的炎性浸潤情況也有所好轉(zhuǎn)。

表3 各組胰腺組織病理評分結(jié)果

S100A12主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞，除在血漿中，在腦脊液、唾液、滑膜液甚至是胃腸黏膜及糞便等中亦可發(fā)現(xiàn)。近來研究表明，S100A12在炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，Rouleau等所做動物實驗證實：通過對小鼠靜脈注射S100A12，發(fā)現(xiàn)骨髓粒細(xì)胞向外周血遷移，進而激活粒細(xì)胞并使之向炎癥區(qū)域趨化[20]。在急性胰腺炎的早期，中性粒細(xì)胞即被激活，釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，是重癥急性胰腺炎引起全身炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[21]。

通過不同時段對各組中各項指標(biāo)的結(jié)果分析：由雨蛙素和脂多糖建立的重癥急性胰腺炎小鼠模型，其血清AMY、CRP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平相對于對照組都明顯升高，S100A12作為一種炎癥應(yīng)答的標(biāo)記物，其血清濃度也明顯上升，而通過事先注射S100A12重組抗體將會使這些炎癥因子水平明顯降低（見表2）。組織病理學(xué)觀察也證實了重癥急性胰腺炎的這種變化：胰腺損傷如間質(zhì)水腫，炎癥浸潤，實質(zhì)壞死和出血都明顯加強，而通過注射S100A12重組抗體后，這些損傷變化又將會得到減輕（圖1，表3）。因此，我們認(rèn)為S100A12能夠作為重癥急性胰腺炎治療的一個有效靶點，通過抑制S100A12的表達(dá)，進而控制重癥急性胰腺炎時中性粒細(xì)胞的過度激活， 就可以通過減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放來減弱急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)，從而為治療重癥急性胰腺炎提供了一個新的策略。

[1] Sekimoto M, Takada T, Kawarada Y, et al. JPN Guidelines for the management of acute pancreatitis: epidemiology, etiology,natural history, and outcome predictors in acute pancreatitis[J]. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2006, 13(1): 10-24.

[2] Granger J, Remick D. Acute pancreatitis: models, markers, and mediators [J]. Shock, 2005, 24 Suppl 1: 45-51.

[3] Mayerle J, Hlouschek V, Lerch MM. Current management of acute pancreatitis [J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol,2005, 2(10): 473-483.

[4] Scheiber-Camoretti R, Mehrotra A, Yan L, et al. Elevated S100A12 and sRAGE are associated with increased length of hospitalization after non-urgent coronary artery bypass grafting surgery [J]. Am J Cardiovasc Dis, 2013, 3(2): 85-90.

[5] Shiotsu Y, Mori Y, Nishimura M, et al. Prognostic utility of plasma S100A12 levels to establish a novel scoring system for predicting mortality in maintenance hemodialysis patients: a two-year prospective observational study in Japan [J]. BMC Nephrol, 2013, 14: 16.

[6] Manolakis AC, Kapsoritakis AN, Georgoulias P, et al. Moderate performance of serum S100A12, in distinguishing inflammatory bowel disease from irritable bowel syndrome [J]. BMC Gastroenterology, 2010, 10: 118.

[7] Lorenz E, Muhlebach MS, Tessier PA, et al. Different expression ratio of S100A8/A9 and S100A12 in acute and chronic lung diseases [J]. Respir Med, 2008, 102(4): 567-573.

[8] Shepherd CE, Goyette J, Utter V, et al. Inflammatory S100A9 and S100A12 proteins in Alzheimer's disease [J]. Neurobiology Aging, 2006, 27(11): 1554-1563.

[9] Komatsuda A, Ohtani H, Wakui H, et al. Increased serum levels of S100A12 in patients with MPO-ANCA-associated glomerulonephritis [J]. Clin Nephrol, 2006, 66(5): 315-321.

[10]Kosaki A, Hasegawa T, Kimura T, et al. Increased plasma S100A12 (EN-RAGE) levels in patients with type 2 diabetes[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89(11): 5423-5428.

[11]Foell D, Wittkowski H, Hammerschmidt I, et al. Monitoring neutrophil activation in juvenile rheumatoid arthritis by S100A12 serum concentrations [J]. Arthritis Rheumatism, 2004, 50(4):1286-1295.

[12]Ye F, Foell D, Hirono K, et al. Neutrophil-derived S100A12 is profoundly upregulated in the early stage of acute Kawasaki disease [J]. Am J Cardiology, 2004, 94(6): 840-844.

[13]Guignard F, Mauel J, Markert M. Identification and characterization of a novel human neutrophil protein related to the S100 family [J]. Biochem J, 1995, 309 (Pt 2): 395-401.

[14]Pietzsch J, Hoppmann S. Human S100A12: a novel key player in inflammation? [J]. Amino Acids, 2009, 36(3): 381-389.

[15]Vaccaro MI, Calvo EL, Suburo AM, et al. Lipopolysaccharide directly affects pancreatic acinar cells: implications on acute pancreatitis pathophysiology [J]. Dig Dis Sci, 2000, 45(5):915-926.

[16]Su KH, Cuthbertson C, Christophi C. Review of experimental animal models of acute pancreatitis [J]. HPB (Oxford), 2006, 8(4): 264-286.

[17]Schmidt J, Lewandrowski K, Fernandez-del Castillo C, et al.Histopathologic correlates of serum amylase activity in acute experimental pancreatitis [J]. Dig Dis Sci, 1992, 37(9): 1426-1433.

[18] Rosty C1, Christa L, Kuzdzal S, et al. Identification of Hepatocarcinoma-Intestine-Pancreas/Pancreatitis-associated Protein I as a Biomarker for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Protein Biochip Technology [J]. Cancer Res, 2002, 62:1868-1875.

[19] 劉樂偉, 徐志紅, 汪茂鳴, 等. 垂盆草對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠的作用及其相關(guān)機制研究 [J]. 肝膽胰外科雜志, 2014,26(2): 121-125.

[20]Rouleau P, Vandal K, Ryckman C, et al. The calcium-binding protein S100A12 induces neutrophil adhesion, migration, and release from bone marrow in mouse at concentrations similar to those found in human inflammatory arthritis [J]. Clinl Immunol,2003, 107(1): 46-54.

[21] Steer M. Pancreatitis severity: Who calls the shots? [J]. Gastroenterology, 2002, 122(4): 1168-1172.