遼寧傳統發酵豆醬中乳酸菌及酵母菌分離鑒定

武俊瑞，王曉蕊，唐筱揚，王茜茜，烏日娜,2,*，岳喜慶

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

傳統發酵豆醬是以大豆為原料，經過煮制、擠壓成塊、制曲、發酵而成，在制曲和發酵過程中，利用原料和環境中的微生物自然發酵，微生物利用蛋白質、脂肪、碳水化合物等大分子物質分解成為小分子的風味物質，使豆醬的pH值和各種養分發生變化[1-5]。由于其良好的風味和營養價值廣受人們歡迎。傳統發酵豆醬中含有異黃酮類、多酚類、大豆皂苷、類黑精、肽類、維生素等大量對人體有益的生理活性物質，具有很好的保健功能[3,5-7]。

豆醬中微生物的種類繁多，包括乳酸菌、酵母菌、霉菌等。乳酸菌是豆醬呈味的主要微生物，可將精氨酸、酪氨酸、組氨酸及天冬氨酸分解，同時對絲氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸等進行特異性脫羧基作用，左右著醬的香氣[8-10]。酵母菌在豆醬發酵過程中主要起著發酵糖類產酸和產生醇類的作用[11-12]。另外乳酸菌與酵母菌協同作用，乳酸和乙醇生成乳酸乙酯，和魯氏酵母生成糠醇，從而產生獨特的醬香氣。同時乳酸菌發酵產生的乳酸使得體系pH值降低，有利于酵母菌的增殖，而酵母菌發酵產生的大量乙醇卻會制約著乳酸菌的繁殖[13]。乳酸菌和酵母菌在豆醬發酵中相互協同也相互影響。

本研究以采自遼寧地區的38份傳統發酵豆醬樣品為實驗材料，從豆醬中分離出乳酸菌和酵母菌疑似菌株，再利用16S rDNA序列分析方法和26S rDNA D1/D2序列同源性分析，對其進行鑒定并保藏，為進一步開發利用豆醬中乳酸菌和酵母菌資源提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

從遼寧省地區傳統手工制醬農家采集豆醬樣品38份，見表1。

表1 樣品采集結果Table1 Geographic sources of samples collected for this study

1.2 培養基與試劑

MRS培養基、馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養基、孟加拉紅瓊脂培養基 本實驗室自行配制。

細菌基因組DNA小量制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 上海桑尼生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

JNOEC XS-212-201生物顯微鏡 日本Olympus公司；5804R型離心機 德國Eppendorf公司；SHP-1500型低溫生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；2720型Thermal Cycler PCR儀 美國ABI公司；Tanon 2500凝膠成像系統 中國天能公司；ND-1000型微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司。

1.4 乳酸菌分離鑒定及其多樣性分析

1.4.1 乳酸菌的分離純化與保存

采用傾注培養法，將豆醬樣品進行10倍梯度稀釋后，取10－4～10－7的樣品稀釋液100 μL于平板中，倒入含有CaCO3的滅菌MRS瓊脂培養基20 mL，混合均勻并凝固后，于30℃培養24～48 h。挑取有鈣圈的單菌落，在滅菌后的MRS固體培養基上反復劃線分離，置于30℃培養24～48 h，確定為單菌落后置于10倍放大鏡下進行菌落形態學觀察，并且進行革蘭氏染色，于100倍光學顯微鏡下進行菌體形態學觀察，并記錄[14-16]。最后用MRS固體培養基進行穿刺保藏。

1.4.2 利用16S rDNA序列分析進行鑒定

1.4.2.1 總DNA的提取及純度的檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取供試菌株基因組DNA[17-18]。使用ND-1000型微量紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度以及OD260nm/OD280nm比值，再用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4.2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rDNA序列

16S rDNA 擴增引物：正向引物為27f：5’-AGAGTTT G A T C C T G G C T C A G-3’；反向引物為1 4 9 5 r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴增反應體系（25 μL）：上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，超純水17.2 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環30次；72℃延伸10 min，4℃保溫[19-20]。

1.4.2.3 檢測16S rDNA擴增片段及測序

取3 μL的PCR產物與1 μL的6×Loading Buffer混合，加入1%的瓊脂糖凝膠點樣孔中，在電壓為5 V/cm，電泳液為0.5×TBE（Tris硼酸）中電泳。電泳結束后，用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）進行染色，染色30 min，將膠板置于凝膠成像系統中觀察。PCR產物檢測后，片段長度約為1 500 bp的陽性產物直接送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定[21-22]。

1.4.2.4 乳酸菌同源性分析和系統發育樹的構建

將所得序列在GenBank數據庫中進行基本局部相似性比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對分析，運用Mega4.0軟件的相鄰計算法構建系統發育樹，判定目的菌的分類地位或它的系統發育地位[18,21]。

1.5 酵母菌分離鑒定及其多樣性分析

1.5.1 酵母菌的分離純化與保存

將豆醬樣品進行梯度稀釋，取10－4～10－7的樣品稀釋液100 μL，均勻涂布在孟加拉紅瓊脂培養基中，25℃培養48 h。挑取與酵母菌菌落形態相符的單個菌落，接于PDA液體培養基中，25℃培養24 h。傳至二代，用平板劃線的方法，接種于PDA瓊脂培養基上，25℃培養48 h[23-24]。挑取培養好的平板上分離出的單菌落，接于PDA液體培養基中依上述純化過程再次純化兩代。用接種環挑取純化過的二代菌種，以劃線的方式保藏于PDA固體斜面上，25℃培養48 h。

1.5.2 酵母菌26S rDNA D1/D2序列同源性分析

1.5.2.1 酵母菌總DNA的提取和純度檢測

采用酵母基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）對酵母菌總DNA進行提取。使用ND-1000型微量紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度和OD260nm/OD280nm比值，用1%的瓊脂糖凝膠對基因組DNA進行電泳檢測。

1.5.2.2 PCR擴增26S rDNA D1/D2序列

26S rDNA D1/D2擴增引物：正向引物為NL1-FA：5’-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAGCATATCAATA AGCGGAGGAAAAG-3’；反向引物為NL4-RA：5’-AG CGGATCACTTCACACAGGAGGTCCGTGTTTCAAG ACGG-3’。PCR擴增反應體系（50 μL）：上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），模板 DNA（100 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，4×dNTP Mix 1 μL，超純水40 μL，rTaq酶1 μL。PCR擴增反應程序為：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s，循環36次；72℃延伸8 min，4℃保溫[23-26]。

1.5.2.3 檢測26S rDNA D1/D2擴增片段及測序

取2 μL的PCR產物與1 μL的6×Loading Buffer混合，加入1%的瓊脂糖凝膠點樣孔中，在電壓為5 V/cm，電泳液為0.5×TBE中電泳。電泳結束后，用EB進行染色，染色30 min，將膠板置于凝膠成像系統中觀察。PCR產物檢測后，將片段長度約為600 bp的陽性產物直接送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定。

1.5.2.4 酵母菌同源性分析

將所得序列在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對分析[25-26]。

2 結果與分析

2.1 豆醬中乳酸菌的分離與鑒定

2.1.1 乳酸菌的表型特征

本實驗共從豆醬樣品中分離出62株乳酸菌，其中有28株球菌（45.2%），34株桿菌（54.8%）。在MRS固體培養基中，菌落形態為乳白色或透明且表面光滑的圓形菌落。菌落直徑集中在0.5～1.5 mm。革蘭氏染色發現62株菌均為革蘭氏陽性菌，菌落形態分為球狀和桿狀，排列方式為單個、成對或短鏈。

2.1.2 乳酸菌總DNA的提取及16S rDNA擴增結果檢測

圖1 部分菌株16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA PCR products from lactic acid bacteria

圖1所示為部分菌株16S rDNA PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，可以觀察到所有泳道的1 500 bp左右位置均出現了一條亮帶，并且無明顯非特異擴增現象，符合測序要求。將PCR片段長度在1 500 bp左右的陽性產物進行序列測定。

2.1.3 乳酸菌16S rDNA同源性分析

將62株乳酸菌16S rDNA擴增產物測序結果同國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫進行BLAST同源性對比分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。結果如表2所示。

表2 乳酸菌16S rDNA序列分析結果Table2 Results of 16S rDNA sequence analysis for 62 LAB strains

由表2可知，DD1-2等19株菌與Lactobacillus plantarum KJ026699.1的同源性達到99%或100%，所以將其鑒定為L.plantarum；DD2-1等14株與Enterococcus faecium FJ972173.1的同源性達到99%或100%，所以將其鑒定為E.faecium；DD1-1等12株菌與Tetragenococcus halophilus FJ715470.1的同源性達到99%或100%，所以將其鑒定為T.halophilus；DD2-2等11株菌與Lactobacillus sakei EU626014的同源性達到99%或100%，所以將其鑒定為L.sakei；SY1-1等4株菌與Lactobacillus fermentum EF371900.1的同源性達到99%或100%，所以將其鑒定為L.fermentum；DL1-1與DL3-2與Pediococcus pentosaceus AJ305321的同源性達到99%或100%，所以將其鑒定為P.pentosaceu。

本研究從遼寧省14個地區采集到的38份樣品中共分離出了62株乳酸菌，通過16S rDNA序列分析后共鑒定出6個種，L.plantarum19株，是樣品中分離數量最多的菌種，除錦州和鞍山外均分離到該菌株，占總數的30.65%；E.faecium有14株，除盤錦、錦州和遼陽外均分離到該菌株，占總數的22.58%；T.halophilus有12株，占總數的19.35%；分離到L.sakei 11株，占總數的17.74%。另外，還分離到4株L.fermentum和2株P.pentosaceus，這2株P.pentosaceus均分離自大連樣品。14個地區中，有85.71%的地區都分離到了L.plantarum，78.57%的地區分離到了E.faecium，有71.43%的地區分離到了T.halophilus，可初步推測這3種菌為遼寧省地區自然發酵豆醬中存在的優勢菌。

2.1.4 豆醬樣品中乳酸菌系統發育樹的構建

根據同源序列的搜索結果，下載相關模式株的序列，利用本地軟件Mega4.0將測得序列與GenBank中的模式菌株16S rDNA序列進行分析，構建系統發育樹（圖2），獲得目的菌的分類地位和它的系統發育地位。

圖2 部分乳酸菌16S rDNA序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria

從系統發育樹（圖2）可以看出，Lactobacillus sakei SY3-1形成了第一群，Lactobacillus plantarum BX2-2和Lactobacillus fermentum CY1-1的16S rDNA序列在進化關系上親緣關系較近，形成了第二類群；Tetragenococcus halophilus FS2-2和Enterococcus faecium DD2-1形成了第三類群，所有分離株與相對應的參考菌株同源性都達到了99%以上，并與其聚在一起，證明乳酸菌16S rDNA區域序列分析結果的準確性。

2.1.5 豆醬樣品乳酸菌生物多樣性分析

本研究從遼寧省14個地區38份樣品中共分離到6個種62株乳酸菌，其中乳球菌為3個種28株（45.16%），乳桿菌3個種34株（54.84%），表3匯總了每個種的乳酸菌的地區分布情況。

表3 各地區豆醬樣品中乳酸菌分離鑒定情況Table3 Distribution of lactic acid bacteria in fermented soybean paste from different regions

由表3可知，從丹東市采集的3個樣品中共分離到4個種（占種數的66.67%）5株乳酸菌（占總菌數的8.06%）；盤錦市采集的2個樣品中分離出乳酸菌3個種（占種數的50%）3株（占總菌數的4.83%）；葫蘆島市的3個樣品中分離出乳酸菌4個種（占種數的66.67%）5株（占總菌數的8.06%）；來自阜新市的3個樣品中分離出4個種（占種數的66.67%）乳酸菌6株（占總菌數的9.68%）；沈陽市的5份樣品中分離出乳酸菌5個種（占種數的83.33%）8株（占總菌數的12.9%）；朝陽市的3份樣品中分離出乳酸菌4個種（占種數的66.67%）乳酸菌4株（占總菌數的6.45%）；撫順市的4份樣品中分離出乳酸菌4個種（占種數的66.67%）乳酸菌7株（占總菌數的11.29%）；本溪市的2份樣品中分離出乳酸菌3個種（占種數的50%）乳酸菌4株（占總菌數的6.45%）；來自錦州市的2個樣品中分離到乳酸菌2個種（占種數的33.33%）2株乳酸菌（占總菌數的3.23%）；大連市采集的3個樣品中分離出4個種（占種數的66.67%）乳酸菌5株（占總菌數的8.06%）；遼陽市采集的2個樣品中分離出3個種（占種數的50%）乳酸菌5株（占總菌數的8.06%）；鞍山市采集的2個樣品中分離出乳酸菌2個種（占種數的33.33%）2株（占總菌數的3.23%）；營口市采集的3個樣品中分離出乳酸菌2個種（占種數的33.33%）4株（占總菌數的6.45%）；鐵嶺市采集的1個樣品中分離出乳酸菌2個種（占種數的33.33%）2株（占總菌數的3.23%）。

2.2 酵母菌分離鑒定及多樣性分析

2.2.1 酵母菌的表型特征

實驗共從豆醬樣品中分離出56株酵母菌。在PDA固體培養基中，菌落顏色為乳白色或奶油色，表面光滑，呈圓形或卵圓形。菌落大而厚，直徑大于3 mm。

2.2.2 酵母菌總DNA的提取及26S rDNA D1/D2擴增結果檢測

圖3為部分菌株26S rDNA D1/D2擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，所有泳道的600 bp左右位置均出現了一條亮帶，并且無明顯非特異擴增現象，符合測序要求。將PCR片段長度在600 bp左右的陽性產物進行序列測定。

圖3 部分菌株26S rDNA D1/D2 PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 26S rDNA D1/D2 PCR products from yeast

2.2.3 酵母菌26S rDNA D1/D2同源性分析

將56株酵母菌26S rDNA D1/D2擴增產物測序結果同NCBI數據庫進行BLAST同源性對比分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。結果如表4所示。

表4 酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析結果Table4 Results of 26S rDNA D1/D2 sequence analysis for yeast

通過在NCBI數據庫進行BLAST同源性對比分析（表4），SY2等18株菌被鑒定為Zygosaccharomyces；SY1-B等13株被鑒定為Candida；SY1-A等14株菌被鑒定為C.parapsilosis；SY3-A等7株菌被鑒定為D.hansenii；BX1-B等4株菌被鑒定為Debaryomyces。

本研究從遼寧省14個地區采集到的38份樣品中共分離出了56株酵母菌，通過26S rDNA D1/D2序列分析后共鑒定出5個種，Zygosaccharomyces18株，是樣品中分離數量最多的菌種，占總數的32.14%；Candida 13株，占總數的23.21%；C.parapsilosis 14株，占總數的25%；分離到D.hansenii 7株，占總數的12.5%。還分離到4株Debaryomyces，分別來自本溪、撫順、遼陽、營口。14個地區中，有34.21%的地區都分離到了Zygosaccharomyces和C.parapsilosis，26.32%的地區分離到了Candida，可初步推測這3種菌為遼寧省自然發酵豆醬中存在的優勢菌。

2.2.4 豆醬樣品酵母菌生物多樣性分析

本研究從遼寧省14個地區38份樣品中共分離到5個種56株酵母菌，表5匯總了每個種的酵母菌的地區分布情況。

表5 各地區豆醬樣品中酵母菌分離鑒定情況Table5 Distribution of yeast in fermented soybean paste from different regions

由表5可知，從阜新市采集的3個樣品中共分離到4個種（占種數的80%）6株酵母菌（占總菌數的10.71%）；沈陽市采集的5個樣品中分離出酵母菌4個種（占種數的80%）7株（占總菌數的12.5%）；大連市的3個樣品中分離出酵母菌4個種（占種數的80%）4株（占總菌數的7.14%）；來自鞍山市的2個樣品中分離出4個種（占種數的80%）乳酸菌4株（占總菌數的7.14%）；營口市的3份樣品中分離出酵母菌4個種（占種數的80%）4株（占總菌數的7.14%）。由此可見，遼寧省阜新市和沈陽市自然發酵豆醬中酵母菌多樣性較好。

3 結 論

本研究從遼寧省14個地區38份樣品中共分離到乳酸菌62株，并用乳酸菌16S rDNA序列分析法對分離到的乳酸菌進行鑒定，鑒定結果為L.plantarum 19株、E.faecium 14株、T.halophilus 12株、L.sakei 11株、L.fermentum 4株、P.pentosaceus 2株。分離到酵母菌56株，經過26S rDNA D1/D2序列分析方法鑒定結果為Zygosaccharomyces 18株、Candida 13株、C.parapsilosis 14株、D.hansenii 7株、Debaryomyces 4株。

14個地區中，有85.71%的地區都分離到了L.plantarum；78.57%的地區分離到了E.faecium；有71.43%的地區分離到了T.halophilus，可初步推測這3種菌為遼寧省自然發酵豆醬中存在的優勢菌。14個地區中，有34.21%的地區都分離到了Zygosaccharomyces和C.parapsilosis，26.32%的地區分離到了Candida，可初步推測這3種菌為遼寧省自然發酵豆醬中存在的優勢菌。

丹東市、沈陽市、阜新市等地區的樣品中乳酸菌的多樣性較好，而營口市和鐵嶺市均發現2種乳酸菌，多樣性較差。遼寧省阜新市和沈陽市自然發酵豆醬中酵母菌多樣性較好。

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