二惡英對內膜組織中細胞色素芳香化酶P450表達的影響

張麗君

二惡英對內膜組織中細胞色素芳香化酶P450表達的影響

張麗君

目的 建立小鼠模型并探討二惡英對小鼠內膜組織中細胞色素芳香化酶P450表達的影響。方法 建立小鼠模型, 采用二惡英0、3、10 μg/kg對小鼠進行宮內、外暴露或宮內宮外聯合暴露,從而將小鼠模型分為五組：0-0組、3-0組、0-3組、3-3組和3-10組, 各有24只小鼠。采用免疫組織化學法檢測小鼠模型中子宮內膜組織中細胞色素芳香化酶P450的表達水平。結果 細胞色素芳香化酶P450在小鼠暴露組的表達高于對照組(P＜0.05), 并隨二惡英暴露劑量的增加而升高(P＜0.05)。結論 二惡英可以促進子宮內膜中細胞色素芳香化酶P450的表達。

二惡英；小鼠模型；細胞色素芳香化酶P450

二惡英是一種常見的環境污染物, 廣泛存在于人類生存環境中, 嚴重威脅人的身體健康。證據表明二惡英與婦科雌激素依賴性疾病的發病關系密切［1］, 細胞色素芳香化酶P450是合成雌激素的限速酶, 主要以合成雌激素而發揮作用。本研究建立小鼠模型, 使用不同劑量二惡英對其進行宮內、外暴露或聯合暴露, 檢測子宮內膜組織中細胞色素芳香化酶P450表達程度, 以探討二惡英對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物建模 參考Audrey M.Cummings1999年鋸齒類動物實驗模式建模。將60只SPF級C57BL/6雌鼠和30只SPF級C3H雄鼠在成熟期以2：1合籠, 將懷孕后的雌鼠隨機分為二惡英組40只和對照組20只。在妊娠的第8天通過給予暴露組口服二惡英類化合物TCDD 3 μg/kg, 母鼠產后共選擇雌性子鼠120只：在原對照組中選擇48只, 分為0 μg/kg和3 μg/kg組。在原暴露組中選擇72只, 分為0 μg/kg、3 μg/kg和10 ug/kg組。根據小鼠二惡英暴露時間及暴露劑量的不同將其分為五組, 0-0組, 3-0組, 0-3組, 3-3組, 3-10組, 每組含24只子鼠。在子鼠出生后第21天和49天給予0-3組、3-3組、3-10組二惡英類化合物各3 μg/kg, 3 μg/kg, 10 μg/kg,出生后第70天將全部小鼠處死, 取其子宮內膜固定備用。

1.2 方法 使用免疫組織化學方法進行連續切片, 常規脫蠟、水化、抗原修復；封閉非特異性抗原30 min, 滴加鼠抗人P450單克隆抗體, 室溫孵育2.5 h, 用PBS沖洗3次, 二抗于室溫下孵育50 min, 后DAB顯色5 min, 清水沖洗終止反應, HE染色, 中性樹膠封片。這種抗體在腺上皮及間質細胞漿中表達, 胞漿內有棕黃色顆粒沉著者即為陽性表達。

1.3 P450表達 免疫組化結果判斷細胞色素芳香化酶P450的表達是腺上皮細胞胞漿內出現有棕黃色的顆粒, 染色結果通過在光鏡下定位, 攝像系統攝取細胞圖像, 之后輸入醫學圖像分析系統進行處理, 以平均光密度計算細胞色素芳香化酶P450的表達情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

細胞色素芳香化酶P450蛋白位于暴露組小鼠子宮內膜腺上皮細胞的胞漿內。0-0組小鼠子宮內膜中沒有細胞色素芳香化酶P450表達, 其余各組均有表達, 3-0組(0.1453±0.0372), 0-3組(0.1729±0.0435), 3-3組(0.2349± 0.0593), 3-10組為(0.2756±0.0322), 其表達量按照0-0組、3-0組、0-3組、3-3組、3-10組的順序依次增加, 任意兩組之間的差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

二惡英主要產生于化工生產、汽車尾氣及城市廢棄物中, 可通過多種途徑進入人體危害人的健康, 其主要方式是通過服用被二惡英污染的水、食物以及吸入含有二惡英類化合物的汽車尾氣。二惡英屬于劇毒化合物, 不能在人體中進行對照研究。因此為了對其進行研究分析, 需要建立動物模型。小鼠具有體型小、生長周期短、成熟早、飼養方便、繁殖力強等特點, 使用小鼠建立動物模型具有相對的優越性。研究表明二惡英對哺乳類動物的生殖系統產生危害［2］, 另有研究表明子宮內膜不僅受到血液循環中雌激素的作用, 還能夠通過自分泌或者旁分泌的方式產生雌激素, 使局部雌激素分泌過多, 為雌激素依賴性疾病的發生創造了條件。細胞色素芳香化酶P450是合成雌激素的限速酶, 通過分泌雌激素對周圍組織產生作用, 本研究通過對小鼠子宮內膜的檢測發現, 細胞色素芳香化酶P450的表達量按0-0組, 3-0組, 0-3組, 3-3組和3-10組的順序依次增加。0-0組沒有細胞色素芳香化酶P450蛋白表達, 3-0組小鼠即母體妊娠期暴露在二惡英中, 其子代小鼠內膜中開始出現細胞色素芳香化酶P450表達, 說明妊娠期暴露促進子代內膜中雌激素的分泌, 導致子代患雌激素依賴性疾病的風險增加。3-3組小鼠和3-0組相比, 子代二惡英暴露增加, 細胞色素芳香化酶P450表達量也增加。說明細胞色素芳香化酶P450的表達隨著二惡英暴露時間的延長而增加, 同時也說明了宮內宮外聯合暴露比單一宮內暴露更能促進細胞色素芳香化酶P450的表達。同樣, 3-3組小鼠和0-3組相比多了一次宮內暴露, 內膜中細胞色素芳香化酶P450表達量也同時增多, 說明二惡英宮內宮外聯合暴露比單一宮外暴露更能促進細胞色素芳香化酶P450的表達, 從而使子宮內膜局部雌激素合成增加, 患雌激素依賴性疾病的風險也更大。在3-10組中, 二惡英暴露次數和3-3組相同, 但劑量加大, 使子宮內膜中細胞色素芳香化酶P450表達量也更大, 說明細胞色素芳香化酶P450表達量隨二惡英劑量增加而增加, 使雌激素分泌進一步增加, 患病風險也更大。Boverhof等的研究也表明二惡英可產生一種類似雌激素的作用。

二惡英是目前國際上公認的最嚴重的生殖危險環境污染物之一, 流行病學調查顯示, 長時間暴露在二惡英中不僅患生殖系統疾病的風險增加, 還能夠增加人體其他疾病的患病率, 如惡性腫瘤等。醫務人員應積極采取相應措施來防范其對人體的危害, 如提倡垃圾及時分類處理, 控制焚燒, 從而降低二惡英類化合物的排放量, 減少二惡英所引起的相關疾病的發生［2］。

［1］ 張麗君, 黃向華.四氯二苯并二惡英與婦科疾病.國際生殖健康/計劃生育雜志, 2011, 30(2):134-137.

［2］ 郭玉梅,王沭沂,王心如.二惡英對獼猴妊娠期及其妊娠結局的毒性影響.中國公共衛生, 2000, 16(11):1001-1002.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.02.183

2014-09-04］

473000 南陽醫專一附院婦科