TGFA基因rs 11466285多態性與東北地區非綜合征性唇腭裂的關系

胥威 盧永平

·實驗研究·

TGFA基因rs 11466285多態性與東北地區非綜合征性唇腭裂的關系

胥威 盧永平

目的 探討轉化生長因子α基因rs11466285位點與東北地區非綜合征性唇腭裂的發病關系。方法 采用基因芯片檢測166例患者(病例組)和150例正常志愿者(對照組)rs11466285的基因型, 并進行χ2分析。結果 基因型和等位基因在病例組與對照組中比較均有顯著性差異(P＜0.01)。結論 中國東北人群轉化生長因子α基因rs 11466285多態與非綜合征性唇腭裂的發病密切相關。

非綜合征性唇腭裂；轉化生長因子；多態性

非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)是一種常見的頜面部先天性畸形, 全世界的發病率約為1/500～1/2500［1］。本研究將探討轉化生長因子α(TGFA)基因rs 11466285多態性與東北地區非綜合征性唇腭裂的發病關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 非綜合征性唇腭裂患者166例(病例組),正常志愿者150例(對照組)。均為東北地區人, 并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、純化、PCR擴增及延伸 將收集到的5 ml外周血, 提取基因組DNA。PCR總體系為20 μl(1×PCR buffer, 0.125 mM dNTPs, 0.4 μM 引物, 0.05 units Ex Taq, 2.5 ng基因組DNA)。反應條件為94℃ 10 min；94℃ 30 s, 5794℃30 s, 7294℃ 30 s, 35個循環；最后7294℃延伸3 min。PCR產物純化以去除多余的dNTPs和引物。特異性引物延伸體系為15 μl ［5 μl PCR產物, 0.375 μl dATP+0.375 μl dTTP+0.375 μl dGTP + 0.375 μl Cy3-dCTP, 0.02U VentR (exo-) DNA 聚合酶, 0.025 μM特異性引物］。反應條件為9494℃ 3 min； 9494℃ 30 s, 5594℃30 s, 7294℃ 45 s, 35個循環；最后7294℃延伸3 min。

1.2.2 雜交與檢測分析 雜交：預先將探針點至在醛基修飾的玻片上。將延伸反應產物混合好陽性對照標記物及雜交液同制作好的芯片雜交反應, 雜交儀60℃雜交1 h。雜交后分別在 2×SSC/1% SDS 洗6 min, 1×SSC/0.2% SDS洗6 min, 0.6×SSC洗3 min, 蒸餾水洗3 min。檢測分析：GenePix 4000 B共聚焦激光掃描儀掃描芯片。讀取每條探針的熒光信號強度值。基因型通過計算每個SNP的等位基因分數(AF)讀取, AF按照下列公式獲得：等位基因B/(等位基因A+等位基因B)。AF＜0.4為等位基因A純合子, 0.4≤AF≤0.6為雜合子AB, AF＞0.6為等位基因B純合子。

1.3 統計學方法 所有數據均采用SPSS18.0軟件進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基因分型 對照組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。為驗證基因芯片檢測結果的準確性, 隨機挑選10%的樣本進行直接測序, 二者結果完全一致。

2.2 病例對照分析 病例組與對照組等位基因和基因型的頻率分布情況及比較, 結果見表1。rs 11466285基因型和等位基因頻率在病例組與對照組中進行比較, 結果差異均有統計學意義(均為P=0.001)。

表1 基因型和等位基因的頻率在對照組和病例組的分布情況及對比分析［n(%)］

3 討論

TGFA基因研究最多的是TaqI、RsaI、C3296T、Primer P、BamHI和PrimerK等位點［2］。目前, rs 11466285多態性與非綜合征性唇腭裂的相關性研究非常少, 中國人群的更少。該SNP位點位于基因的3’非編碼區, 該區域轉錄成350個多聚腺苷酸的反義mRNA片段。如果該反義mRNA片段通過與TGFA基因rs 11466285SNP相互作用來調節TGFA的表達, 那么該SNP很可能與非綜合征性唇腭裂發病相關。本研究運用病例-對照法分析了rs 11466285多態與中國東北非綜合征性唇腭裂的發病關系。

沈亞等［3］研究中國南方人群rs 11466285多態與非綜合征性唇腭裂的關系時, 得到了矛盾的結果, 單體型相對風險分析其與發病密切相關, 核心家庭傳遞不平衡檢驗其與發病不相關。本研究以中國東北人群為實驗對象, 發現基因型和等位基因的頻率在病例與對照中均有顯著性差異, 且病例組等位基因C頻率為19%,高于對照組的9%, 說明攜帶等位基因C與非綜合征性唇腭裂的發病密切相關。

［1］ van den Boogaard MJ, Dorland M, Beemer FA, et al.MSX1 mutation is associated with orofacial clefting and tooth agenesis in humans.Nat Genet, 2000, 24(4):342-343.

［2］ Machida J, Yoshiura K, Funkhauser CD, et al.Transforming growth factor-alpha (TGFA) : genomic structure, boundary sequences, and mutation analysis in nonsyndromic cleft lip/palate and cleft palate only.Genomics, 1999, 61(3):237-242.

［3］ 沈亞, 程璐, 萬偉東, 等.非綜合征性唇腭裂與干擾素調節因子6和轉化生長因子α單核苷酸多態性的相關性.中華檢驗醫學雜志, 2007, 30(12):1349-1353.

Relation between polymorphism of TGFA gene rs 11466285 and non-syndromic cleft lip and palate in Northeast China

XU Wei, LU Yong-ping.Liaoning Provincial Research Institute of Family Planning, Shenyang 110031, China

Objective To explore the relation between transforming growth factor α gene rs 11466285 and non-syndromic cleft lip and palate in Northeast China.Methods The detection by gene microarray was applied in showing the genotype of rs 11466285 in 166 patients (case group) and 150 healthy volunteers (control group).X2 analysis was also used in the detection.Results There was statistically significant difference of genotype and allele between patients and control group.Conclusion The relation between transforming growth factor α gene rs 11466285 and non-syndromic cleft lip and palate in Northeast China is closely correlated.

Non-syndromic cleft lip and palate; Transforming growth factor; Polymorphism

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.02.181

2014-09-12］

出生缺陷干預新技術的研究-唇腭裂易感基因檢測芯片的研制(項目編號：2009225007-7)

110031 遼寧省計劃生育科學研究院