MiR-429對人U87膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其作用機制

陳亮宇，劉麗波，李新星，喻博，洪楊，鄭健，于奇，薛一雪，劉云會

（中國醫科大學 1.盛京醫院神經外科，沈陽 110004；2.基礎醫學院神經生物學教研室，沈陽 110122）

·論著·

MiR-429對人U87膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其作用機制

陳亮宇1，劉麗波2，李新星1，喻博1，洪楊1，鄭健1，于奇1，薛一雪2，劉云會1

（中國醫科大學 1.盛京醫院神經外科，沈陽 110004；2.基礎醫學院神經生物學教研室，沈陽 110122）

目的研究miR-429對人U87膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能機制。方法培養人U87膠質瘤細胞，應用Lipofectamine?LTX試劑將pre-miR-429質粒以及anti-miR-429質粒（shRNA質粒載體）穩定轉染人U87膠質瘤細胞，real-time PCR驗證轉染效率后，應用CCK-8檢測增殖能力的變化；使用Transwell小室法檢測人U87膠質瘤細胞遷移和侵襲能力的變化；應用real-time PCR和Western blot檢測E盒結合鋅指蛋白1（ZEB1）mRNA和蛋白表達含量變化；將ZEB1分別轉染至U87膠質瘤細胞或miR-429過表達的U87膠質瘤細胞，應用Transwell小室檢測miRNA-429和ZEB1分別過表達或二者雙過表達對人U87膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。結果與對照組比較，miR-429過表達顯著抑制了人U87膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力；顯著降低了ZEB1在人U87膠質瘤細胞的mRNA和蛋白表達水平；ZEB1過表達顯著增強了人U87膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力；并且ZEB1過表達有效阻斷了miR-429抑制U87膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用。結論miR-429能夠通過抑制ZEB1降低人U87膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲能力。

miR-429；E盒結合鋅指蛋白1；人U87膠質瘤細胞；增殖；遷移；侵襲

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）起源于神經外胚層，大約占成人顱內腫瘤的1/4，是中樞神經系統最常見的高度惡性腫瘤。即使采用手術聯合放化療等積極的治療，GBM的中位生存期也僅為12～15個月［1］，預后不良。因此，深入研究GBM發生發展機制，能夠為GBM的診斷和治療提供重要依據［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是由21～25個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈RNA分子?？梢栽谵D錄后水平通過降解或抑制靶mRNA翻譯過程而發揮負向調控作用，其影響細胞增殖、分化、凋亡等過程對人體腫瘤的發生、發展具有重要的調節作用［3］。MiR-429是miR-200家族中的一員，在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中相對于正常組織低表達，作為腫瘤抑制性miRNA發揮作用，能夠抑制腫瘤的發生［4～6］。

E盒結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）是具有鋅指結構的轉錄因子，位于人類10號染色體短臂，包含2個鋅指結構簇和1個同源結構域［7］。近來有研究表明，ZEB1在肺癌、乳腺癌、子宮內膜癌，包括膠質瘤中呈高表達，在腫瘤的發生發展過程中起重要作用［8～11］。包括miR-429在內的miR-200家族與ZEB1形成負反饋平衡系統，ZEB1與miR-200家族成員之間在上皮以及間質相互轉化以及彼此基因的表達水平方面相互負性調控。ZEB1對miR-200家族的調控是轉錄抑制；miR-200家族對ZEB1的作用為轉錄后抑制［12～14］。本研究旨在探討miR-429對U87膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用以及相關機制，為膠質瘤的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM（高糖）細胞培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；人pre-miR-429和antimiR-429的shRNA質粒載體（上海吉瑪制藥有限公司）；轉染試劑Lipofectamine?LTX（美國Invitrogen公司）；G418（美國Sigma-Aldrich公司）；Cell Counting Kit-8（日本同仁化學研究所）；Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel基底膜（美國BD公司）；Trizol（美國life公司）；miR-429以及U6引物（美國Applied Biosystems公司）；多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；正置顯微鏡（日本Olympus公司）；二氧化碳培養箱（美國Forma Scientific公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Real-time PCR儀（（美國ABI公司）；ZEB1過表達質粒（美國origene公司）；TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit（美國life公司）；TaqMan?Universal PCR Master Mix II，with UNG（美國life公司）；一步法熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；miR-429、ZEB1引物序列（上海生工生物工程技術服務有限公司）；兔抗ZEB1抗體、鼠抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠及羊抗兔二抗（美國SANTA CRUZ公司）。

1.2 細胞培養

人U87膠質瘤細胞株由中國醫科大學神經生物學教研室保存。用DMEM高糖培養基加10%胎牛血清培養U87細胞，置37℃、5%CO2培養，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞轉染

在24孔板中，每孔接種4×104個U87細胞，培養基不加抗生素。待細胞生長至80%融合度時，按照Lipofectamine?LTX說明書，分別給予pre-miR-429以及anti-miR-429質粒以及空質粒對照，并且每孔0.5 μL Plus Reagents以及1.7μL LTX。使用0.4 mg/mL G418篩選細胞。4周后，篩選出穩定轉染的細胞系：pre-miR-429、pre-miR-429-NC、anti-miR-429和antimiR-429-NC。按照上述程序，針對pre-miR-429-NC以及pre-miR-429細胞系，將ZEB1穩轉其中。篩選出以下穩定轉染細胞系：pre-NC+ZEB1（+）、pre-NC+ ZEB1-NC、pre-miR-429+ZEB1（+）和pre-miR-429+ ZEB1-NC。

1.4 細胞活力測定

細胞活力采用CCK-8方法檢測。制備U87細胞懸液，以每孔100 μL含1×104細胞數接種于96孔板，培養24 h后，各組終止反應棄去培養液，加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h，用酶標儀測定450 nm波長處各孔光吸收值。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 miR-429檢測：用Trizol提取細胞的總RNA，使用分光光度儀計量RNA水平；應用Invitrogen公司的Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit，Taqman Universal Master MixⅡ試劑盒，以U6為內參基因，檢測miR-429。采用比較Ct值法（2-ΔΔCt法）對獲得的數據進行相對定量分析。

1.5.2 ZEB1檢測：用Trizol提取細胞的總RNA，使用分光光度儀計量RNA水平；一步法熒光定量PCR試劑盒，以GAPDH為內參基因，檢測ZEB1。采用比較Ct值法（2-ΔΔCt法）對獲得的數據進行相對定量分析。

1.6 體外遷移和侵襲實驗

在孔徑為8 μm的Transwell小室的上室底膜表面鋪40 μL稀釋的Matrigel膠（1∶3），37℃孵育30 min。用無血清DMEM培養液將各組細胞的濃度調整為2×105/mL，在上室加入100 μL細胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2培養24 h；棄去上室培養液，無水甲醇固定30 min，濕棉簽擦去上室未過膜細胞，0.1%結晶紫染色20 min；在倒置顯微鏡下計數上室底膜上、下、左、右、中5個視野的細胞總數（×200）。細胞遷移實驗除上室底膜未用Matrigel膠包被外，其余步驟同侵襲實驗。

1.7 蛋白免疫印跡

檢測miR-429過表達組和沉默組中ZEB1的蛋白表達。用RIPA裂解液分別提取各組總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，然后應用SDS-PAGE進行電泳，后將蛋白轉印至PVDF膜上，在含有5%脫脂奶粉TTBS溶液中常溫封閉2 h，然后分別加入兔抗ZEB1抗體（1∶1 000稀釋）和鼠抗GAPDH抗體（1∶5 000稀釋），4℃孵育過夜。TTBS洗滌，經相應二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育2 h。用增強化學發光法檢測免疫復合物的表達。采用Chemi Imager 5500 V2.03軟件對蛋白條帶進行掃描，用Fluor Chen 2.0計算機圖像分析系統計算各條帶整合光密度值（integrated density values，IDV）。結果以ZEB1/GAPDH的IDV比值表示。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR檢測miR-429相關表達變化

在雙向穩定轉染miR-429后，應用real-time PCR驗證轉染效率。與對照組相比，pre-miR-429-NC組和anti-miR-429-NC組中miR-429的mRNA表達水平無明顯變化（0.92±0.12 vs 1.00±0.13，P＞0.05；1.17±0.14 vs 1.00±0.13，P＞0.05）；與pre-miR-429-NC組相比，pre-miR-429組中miR-429的mRNA表達水平增加5.9倍（5.90±0.56 vs 0.92±0.12，P＜0.01）；與anti-miR-429-NC組相比，anti-miR-429組中miR-429的表達（0.23±0.05）水平降低4.3倍（P＜0.01）。

2.2 miR-429對U87膠質瘤細胞增殖的影響

與對照組相比，pre-miR-429-NC和anti-miR-429-NC組U87膠質瘤細胞的細胞活力無明顯變化（1.12±0.10 vs 1.00±0.09，P＞0.05；0.93±0.12 vs 1.00± 0.09，P＞0.05）；與pre-miR-429-NC組相比，miR-429過表達后，U87膠質瘤細胞的增殖能力明顯下降（0.58±0.07 vs 1.12±0.10，P＜0.01）；與anti-miR-429-NC組相比，miR-429沉默后，U87膠質瘤細胞的增殖能力明顯增強（1.67±0.13 vs 0.93±0.12，P＜0.01）。

2.3 miR-429對U87膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力的影響（圖1）

圖1 穩轉miR-429過表達以及沉默質粒后細胞遷移以及侵襲的變化Fig.1 Changes in cell migration and invasion of U87 after stable transfection with pre-miR-429 and anti-miR-429 plasmids

與對照組相比，pre-miR-429-NC和anti-miR-429-NC組U87細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目無明顯變化；與pre-miR-429-NC組相比，miR-429過表達后，U87細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目顯著降低；與anti-miR-429-NC組相比，miR-429沉默后，U87細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目顯著增多；以上結果表明miR-429能夠顯著抑制U87細胞的侵襲能力。此外，miR -429對U87膠質瘤細胞遷移能力的影響與侵襲能力相一致，能夠抑制U87細胞的遷移能力。

2.4 miR-429對ZEB1mRNA和蛋白表達的影響

與對照組相比，pre-miR-429-NC和anti-miR-429 -NC組U87膠質細胞中ZEB1的mRNA表達水平無明顯變化；與pre-miR-429-NC組相比，miR-429過表達后，U87細胞中mRNA的表達水平顯著降低；與anti-miR-429-NC組相比，miR-429沉默后，U87細胞中mRNA的表達水平顯著顯著增多；以上結果表明miR-429能夠顯著抑制U87細胞中mRNA的表達水平；此外，miR-429對U87膠質瘤細胞中ZEB1蛋白表達水平的調控與mRNA的表達水平變化相一致，上述結果表明miR-429能夠在mRNA和蛋白水平上抑制ZEB1的表達（圖2）。

圖2 雙向轉染miR-429后ZEB1的mRNA及蛋白水平Fig.2 The expression levels of mRNA and protein of ZEB1 after two-way transfection with miR-429

2.5 miR-429和ZEB1分別過表達以及二者雙過表達后的U87細胞活力改變

與對照組相比，pre-NC+ZEB（+）-NC組U87膠質瘤細胞的細胞活力無明顯變化（0.95±0.10 vs 1.00± 0.08，P＞0.05）；與pre-NC+ZEB（+）-NC組相比，miR-429過表達后，U87細胞的增殖能力明顯下降（0.52± 0.04 vs 0.95±0.10，P＜0.01）；ZEB1過表達后，U87細胞的增殖能力明顯增強（1.95±0.17 vs 0.95±0.10，P＜0.01）；二者雙過表達后U87細胞的增殖能力無明顯改變（1.13±0.09 vs 0.95±0.10，P＞0.05）。

2.6 miR-429和ZEB1分別過表達以及二者雙過表達后的U87細胞遷移和侵襲能力改變

與對照組相比，pre-NC+ZEB（+）-NC組U87膠質瘤細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目無明顯變化；與pre-NC+ZEB（+）-NC組相比，miR-429過表達能夠引起U87細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目明顯下降；ZEB1過表達導致U87細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目明顯增強；二者雙過表達后，U87細胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數目無明顯改變（圖3）。此外，分別過表達miR-429和ZEB，以及二者雙過表達對U87膠質瘤細胞遷移能力的影響與侵襲能力相一致（圖3）。

3 討論

MicroRNA（miRNA）與靶基因mRNA的3′非翻譯區（3′untranslated region，3′UTR）完全或者不完全互補配對從而發揮負性調節的作用，參與轉錄后基因表達的調控［3］。miR-200家族（miR-200b/c/429，miR-200a/141）通過對細胞周期、分化、凋亡等的調控作用，參與到腫瘤發生發展過程中。研究發現，miR-200家族作為發揮抑制腫瘤作用相對多見［5］。miR-200家族（包括miR-429）在神經膠質瘤中是潛在的抑癌基因［12，15］。探討miR-429對腫瘤的影響及機制，可能為神經膠質瘤的治療及相關研究提供新的策略。

圖3 分別過表達miR-429和ZEB，以及二者雙過表達后U87細胞的遷移和侵襲能力變化Fig.3 Changes in cell migration and invasion abilities after transfection with single overexpressed and co-expressed miR-429 and ZEB1

ZEB1是一種E盒結合鋅指蛋白，和其輔助因子共同結合在上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）啟動子的E盒上，抑制基因轉錄和E-cadherin的表達。所以，作為E-cadherin的重要阻遏蛋白，是研究腫瘤細胞上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）分子調控機制網絡的關鍵樞紐［16］。而且ZEB1也是胚胎發育和細胞分化的重要轉錄因子，ZEB1的末端都有鋅指簇，可識別并結合CDH1的E-box（CACCTG）序列，抑制CDH1的轉錄，進而調控EMT進程，控制腫瘤的惡性生物學行為［17］。miRNA-200是最早被發現參與EMT調控的miRNA，miR-200a和miR-200b可通過抑制ZEB1的轉錄，阻止細胞的EMT［18］。在上皮性卵巢癌中，miR-429通過控制ZEB1、ZEB2進而調節其EMT以及遷移的生物學行為［12］。

miR-429抑制直結腸癌細胞的增殖和侵襲，并且通過靶向Onecut2調控EMT相關基因［19］；miR-429調節卵巢癌細胞間質內皮改變，增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性［20］；miR-429通過與ZEB1的相互作用發揮對骨肉瘤細胞中發揮抑癌作用［21］。miR-429在多種腫瘤中發揮抑癌基因的作用，并且其生物學行為和EMT相關［19～21］。有報道稱，miR-200a以及miR-200b對膠質瘤細胞的生長起抑制作用［22，23］。miR-429與miR-200a、miR-200b同屬miR-200家族，但其是否在膠質瘤中發揮明顯生物學作用尚無相關報道。本研究發現，miR-429過表達后可以顯著抑制U87細胞的增殖、遷移和侵襲能力；沉默時作用相反。提示miR-429在膠質瘤中作為抑癌基因發揮作用。應用多種生物預測軟件，包括TargetScan，microRNA.org，miRDB和PITA均能預測到miR-429和ZEB1有結合，而ZEB1在EMT中起重要作用［6，24］，我們進一步檢測pre-miR-429以及anti-miR-429處理后U87膠質瘤細胞中ZEB1的mRNA以及蛋白表達水平變化，證實了miR-429負性調控ZEB1的表達。但miR-429是否通過ZEB1發揮腫瘤抑制作用，尚不清楚。為此，我們進一步檢測了miR-429和ZEB1的分別過表達，以及二者雙過表達后對U87膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響，發現ZEB1可以有效阻斷miR-429對U87細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-429能夠顯著降低人U87神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與miR-429抑制ZEB1的表達有關。

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（編輯 武玉欣）

The Effectand Mechanism ofmiR-429 Regulating Proliferation，Migration and Invasion of Human U87 Glioma Cells

CHENLiang-yu1，LIULi-bo2，LIXin-xing1，YUBo1，HONGYang1，ZHENG Jian1，YUQi1，XUE Yi-xue2，LIUYun-hui1
（1.DepartmentofNeurosurgery，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China；2.DepartmentofNeurobiology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China）

Objective To study the effects ofmiR-429 on proliferation，migration and invasion ofhuman glioma U87 cellsand the potentialmechanism.MethodsAfter human U87 glioma cells were cultured，Lipofectamine?LTX was applied to stably transfect U87 glioma cells with pre-miR-429 and anti-miR-429 plasmids（shRNA plasmid vector）.After verification of the efficiency of transfection by real-time PCR，CCK-8 was applied to detect the change in proliferation of U87 cells.The Transwell chamber assay was applied to measure the change in migration and invasion of human U87 glioma cells，the real-time PCR and the Western blotassay were applied to measure the change in mRNA and protein levelsofzinc finger E-box binding homeobox 1（ZEB1）.NormalU87 cells and miR-429-overexpressing U87 cells were transfected with ZEB1，and the Transwellchamber assay was applied to detect the effect of single overexpressed or co-overexpressed miR-429 and ZEB1 on proliferation，migration and invasion of human U87 glioma cells.ResultsCompared with the control group，overexpression of miR-429 significantly inhibited the proliferation，migration and invasion ability of U87 cells and obviously reduced the expression level of mRNA and protein of ZEB1 in human U87 glioma cells.Overexpression of ZEB1 dramatically improved the proliferation，migration and invasion of human U87 glioma cells，furthermore，effectively blocked the function of miR-429 overexpression inhibiting proliferation，migration and invasion.ConclusionMiR-429 reduces proliferation，migration and invasion ofU87 glioma cells by inhibiting ZEB1.

miR-429；zinc finger E-box binding homeobox 1；human U87 glioma cells；proliferation；migration；invasion

R-338.2；R341.6

A

0258-4646（2015）09-0769-06

國家自然科學基金（81402573，81372484，81372682，81272564，81172197，81171131）

陳亮宇（1980-），男，講師，碩士.

劉云會，E-mail：liuyh@sj-hospital.org

2014-12-26

網絡出版時間：