單純皰疹病毒Ⅰ型的Th細胞和B細胞表位重組核酸疫苗的構建及真核表達

劉賢潔，孫原，馬小力

（1.中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽 110001；2.華北理工大學附屬醫院神經內科重癥病房，河北 唐山 063000）

·論著·

單純皰疹病毒Ⅰ型的Th細胞和B細胞表位重組核酸疫苗的構建及真核表達

劉賢潔1，孫原2，馬小力1

（1.中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽 110001；2.華北理工大學附屬醫院神經內科重癥病房，河北 唐山 063000）

目的構建單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）糖蛋白B（gB）和糖蛋白D（gD）的Th細胞和B細胞表位重組串聯核酸疫苗，并鑒定其真核表達。方法利用生物信息學分析軟件預測HSV-1 gB和gD的Th細胞表位和B細胞表位，結合已發表文獻，設計合成HSV-1的Th細胞和B細胞表位重組串聯抗原基因（Th/B基因）。將Th/B基因定向克隆入真核表達載體pVAX1，構建真核表達質粒pVAX1-Th/B。用制備的質粒轉染COS-7細胞，裂解細胞后經Western blot鑒定其蛋白表達。結果預測得到了HSV-1 gB和gD的Th細胞和B細胞表位，成功構建真核表達質粒pVAX1-Th/B，經測序確認序列正確。SDS-PAGE分離出相應大小的蛋白表達片段，經Western blot鑒定并證實該重組核酸疫苗能夠在體外真核細胞中表達。結論成功構建HSV-1 Th細胞和B細胞表位重組串聯核酸疫苗，并能夠在體外真核細胞中表達，為HSV-1核酸疫苗的進一步研究打下基礎。

單純皰疹病毒；Th細胞和B細胞表位；核酸疫苗

單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virusⅠ，HSV-1）是一個嗜神經的雙鏈DNA病毒，可以終身潛伏性感染神經元和膠質細胞。HSV-1感染宿主后引起角膜免疫病理反應并發生單純皰疹病毒性角膜炎，感染的HSV-1長期潛伏在三叉神經節內，導致角膜反復感染而最終導致失明，是一種嚴重的致盲性眼病［1］。目前單純皰疹病毒性角膜炎的治療主要還是依賴抗病毒藥物，但現有抗病毒藥物不但具有一定的毒副作用，使耐藥毒株增加，而且不能預防病毒感染和復發。因此，研制預防HSV-1感染及復發的疫苗具有重要意義［2，3］。本研究通過預測HSV-1糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋白D（glycoprotein D，gD）的Th細胞表位和B細胞表位，構建HSV-1 Th細胞和B細胞表位重組串聯抗原疫苗，為今后進一步研究HSV-1核酸疫苗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌種及細胞：pVAX1質粒和表達菌DH5α感受態細胞由本實驗室保存。COS-7細胞為非洲綠猴的腎細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 分子生物學試劑：NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Polymerase Taq DNA聚合酶、質粒抽提試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。Histag抗體購于康為世紀公司，羊抗小鼠IgG-HRP購于碧云天公司，Attractene轉染試劑購于QIAGEN公司，其余試劑均為國產或進口分析純以上產品。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1 Th細胞、B細胞表位重組串聯抗原疫苗的設計：根據GenBank上公布的HSV-1（17株）的基因序列，獲得gB和gD的氨基酸序列。利用生物信息學分析軟件預測HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細胞和B細胞表位。生物信息學主要組織相容性復合體Ⅰ類分子預測采用BIMAS（http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）和 IEDB（http：// www.iedb.org）。生物信息學B細胞表位預測采用網絡服務器Bcepred（http：//www.imtech.res.in/raghava/ bcepred/bcepred_submission.html）和IEDB。結合已發表的文獻，優化選擇抗原表位的編碼基因，綜合各項結果確定HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細胞和B細胞表位。按照表位在基因組上的順序，在各表位間添加適合的Linker設計Th細胞和B細胞表位盒，并通過蛋白二級結構預測網絡服務器SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auomat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html）和蛋白酶體切割預測網絡服務器PAPROC（http：//www.Paproc.de）優化表位盒的構成和Linker的選擇。在此基礎上在表位盒中加入內質網信號引導序列（Igκ鏈信號序列）和泛DR輔助T細胞表位（pan-DR helper T cell epitope，PADRE），以輔助表位更好地突破主要組織相容性復合體限制性而發揮功能，加入蛋白酶有限識別基序（GPGPG）作為間隔序列，起始端引入Kozak序列［4］介導mRNA翻譯起始，末端加入His標簽，兩端加入NheⅠ/XhoⅠ酶切位點。根據設計的表位盒，復原其核苷酸序列，并參照真核優勢密碼子規則進行優化，設計Th/B基因。

1.2.2 真核表達質粒pVAX1-Th/B的構建：Th/B基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。Th/B基因定向克隆入真核載體pVAX1構建真核表達質粒pVAX1-Th/B，將質粒pVAX1-Th/B轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提取質粒，NheⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定并交付金唯智公司DNA測序。

1.2.3 細胞轉染：取對數生長期的COS-7細胞接種于6孔板中，每孔細胞懸液2 mL，每孔接種細胞5× 105個。于37℃、5%CO2的培養箱內平衡30 min后，加入轉染試劑Attractene轉染試劑和去內毒素提取的pVAX1-Th/B質粒，另設空載體轉染對照組，每組均設2個復孔，用無血清的DMEM培養基于37℃、5%CO2的培養箱中培養，24 h后收集細胞。

1.2.4 Western blot鑒定蛋白表達：將收集到的細胞加入細胞裂解液，靜置5 min，用低溫冷凍離心機離心10 min（12 000 r/min，4℃），分離上清為所得到的蛋白質抽提物。用5×Loading Buffer和PBS稀釋蛋白樣品，在沸水浴中煮沸5 min，制成上樣液，進行SDS-PAGE電泳（濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為13%，本次實驗的上樣體積20 μL，含40 μg蛋白，加入蛋白Marker體積為5 μL）。取適當大小的PVDF膜用“三明治”法進行轉膜，轉膜結束后取出PVDF膜進行封閉。以稀釋比例1∶1 500的His-tag抗體為一抗工作液，倒入雜交袋中，放入封閉好的PVDF膜，壓膜機封口后置于4℃冰箱過夜孵育一抗。將孵育一抗后的PVDF膜從雜交袋中取出，洗膜。以稀釋比例1∶1 500的羊抗小鼠IgG-HRP為二抗工作液，倒入雜交袋中，放入漂洗好的PVDF膜，壓膜機封口后置于37℃溫箱45 min孵育二抗。將孵育二抗后的PVDF膜從雜交袋中取出，以ECL底物發光法在暗室進行曝光。

2 結果

2.1 HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細胞表位和B細胞表位

利用生物信息學分析軟件預測HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細胞和B細胞表位，結合已發表文獻，篩選出10個抗原表位，各抗原表位來源及氨基酸序列見表1。進一步優化表位設計，確定Th/B基因序列，設計的重組多表位串聯基因長873 bp，編碼280個氨基酸殘基。

2.2 Western blot鑒定Th/B基因的蛋白表達

將經過SDS-PAGE電泳分離的蛋白條帶經Western blot鑒定（圖1），結果顯示Th/B組出現了Histag的陽性識別條帶，大小約30 kDa。而對照組則未見該區域條帶，無目的蛋白的表達。

3 討論

HSV-1的結構復雜，由雙鏈DNA和病毒染色質磷蛋白組成核，20面體核殼包繞其上，核殼又被糖蛋白、碳水化合物及脂質所構成的包膜所包繞。HSV-1的包膜糖蛋白是細胞免疫和體液免疫的主要靶標，也是目前HSV疫苗的研究熱點。目前已知HSV-1至少有12種糖蛋白［5］，其中gB和gD是病毒復制、穿入、細胞間擴散以及病毒囊膜與感染的細胞膜相融合所必需糖蛋白。gD是抗HSV感染中重要的保護性抗原，能保護動物免受HSV的攻擊，抑制潛伏感染的發生，甚至在潛伏感染已建立后，也能減輕其復發［6］。gB在皰疹病毒家族中是高度保守蛋白，是病毒復制必需蛋白，也是宿主免疫反應的主要靶抗原，能誘導體液免疫、細胞免疫和細胞毒性T淋巴細胞反應［7］。目前，以HSV gD和gB為靶標的疫苗研究是HSV疫苗研究的熱點［8］，已有研究證實gB和gD疫苗在預防角膜炎發生以及減少角膜新生血管形成上具有顯著療效。雖然gB疫苗或gD疫苗的單一使用均可產生一定的免疫保護作用，但不能完全避免單皰病毒性角膜炎的發生，也不能清除病毒的潛伏感染，單一接種gB或gD疫苗后部分小鼠體內仍可檢測到病毒復制，說明任何單一的糖蛋白疫苗免疫作用均不完善［9］，單皰病毒糖蛋白聯合疫苗或多表位疫苗可能是預防和治療HSV較為理想的疫苗。

表1 重組多表位串聯基因Th/B基因的抗原表位來源和序列Tab.1 Position and sequence of recombinant multi-epitope gene（Th/B gene）

圖1 重組Th/B基因的蛋白表達Fig.1 Protein expression of recombinant Th/B gene

核酸疫苗被稱為最有前景的第三代疫苗，作為一種新型的免疫手段，已經在感染性疾病和腫瘤的防治中展現了巨大的潛力，日益受到關注與重視。與傳統的蛋白為基礎的疫苗相比，核酸疫苗不僅可激發機體的體液免疫還可激發細胞免疫，便于修飾加工、進行免疫調節，特別是可以把不同抗原的多個優勢抗原表位組合制備多表位疫苗，能夠對機體形成多特異性、多層次的免疫保護，遠遠大于單抗原的保護能力。目前新發展的基于計算機生物信息學的抗原表位預測方法，使新表位的發現效率提高10～20倍，實驗工作量減少95%，節約研究成本和時間，很大程度上加快了新表位的發現效率［10］，為我們研究HSV-1疫苗提供了新的思路。

因此，本研究選擇HSV-1 gB和gD作為標靶抗原，應用生物信息學技術，采用計算機表位預測方法，預測HSV-1 gB和gD的Th細胞表位和B細胞表位。為使基因有效表達，在核酸5’端中加入Kozak序列（AATMG），它是真核生物mRNA 5’端帽子結構后的一段核酸序列，是提高基因表達的一個上游調控元件，可與翻譯起始因子結合，介導翻譯起始，增強外源基因在細胞內的表達。添加了內質網引導信號以促進表位信號更高效率的合成和折疊。另外，在設計中還加入了PADRE，由13個氨基酸殘基組成（AKFVAAWTLKAAA），可以與人類的多數HLA-DR分子及部分小鼠的Ⅱ類基因分子結合。PADRE不僅能增加Th細胞的反應效能，比自然源性Th細胞表位高1 000倍，能增強核酸疫苗激發細胞免疫的能力；也可為B細胞表位及碳水化合物抗原提供輔助作用，同時誘導體液免疫及細胞免疫，對人體安全、無毒副作用。表位間采用了“GPGPG linker”，以減少表位間的干擾使之獨立發揮功能。本研究對HSV-1 Th細胞、B細胞表位重組核酸疫苗進行了多步優化設計，并已證實可在真核細胞中表達，為今后的HSV-1疫苗研制打下基礎。目前關于該疫苗的免疫原性和免疫保護性還有待進一步研究。

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（編輯 陳 姜）

Construction and Eukaryotic Expression of HSV-1 Th and BLymphocytes Recombinant Multi-epitope DNAVaccine

LIUXian-jie1，SUN Yuan2，MAXiao-li1

（1.Department of Ophthalmology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurology，Affiliated Hospital of North China University ofScience and Technology，Tangshan 063000，China）

Objective To construct the recombinant multi-epitope DNA vaccine of HSV-1 Th and B lymphocytes of gB-gD protein，and to identify its eukaryotic expression.MethodsThe epitopes ofHSV-1 gB-gDprotein were analyzed by bioinformatics analysis software.HSV-1 Th and Blymphocyte recombinantmulti-epitope gene（Th/B gene）was designed and synthesized.Th/B gene was cloned into pVAX1 to synthesize pVAX1-Th/B. pVAX1-Th/B was then transfected into COS-7 cell，and the protein expression was identified by Western blot.ResultsThe epitopes of Th and B lymphocytes of HSV-1 gB and gD were predicted，and the eukaryotic expression plasmid pf pVAX1-Th/B was successfully constructed and confirmed by sequencing.In addition，the in vivo protein expression of the recombinant DNA was confirmed by Western blot.ConclusionHSV-1 Th and B lymphocyte recombinant multi-epitope DNA vaccine was successfully synthesized in this study.HSV-1 Th and B lymphocyte recombinant multi-epitope DNAvaccine can be successfully expressed in isolated eukaryotic cells.This study provides a feasible solution fordeveloping DNAvaccine againstHSV-1 infection.

herpes simplex virus；Th cell and B cell epitope；DNA vaccine

R772.2

A

0258-4646（2015）09-0796-04

國家自然科學基金（81200656）；遼寧省博士啟動基金（20111097）

劉賢潔（1986-），女，醫師，碩士研究生.

馬小力，E-mail：xiaolimax@gmail.com

2015-04-20

網絡出版時間：