自發性高血壓大鼠血液中SOD、MDA、NO、ET的變化及瑞舒伐他汀干預的影響

閆洪娟，謝悅陶，劉 光，于明月，邊樹懷，羅秋華

(1.河北省邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056000；2.河北省人民醫院，河北 石家莊 050000；3.河北醫科大學第四醫院，河北 石家莊 050000)

自發性高血壓大鼠血液中SOD、MDA、NO、ET的變化及瑞舒伐他汀干預的影響

閆洪娟1，謝悅陶2，劉 光3，于明月2，邊樹懷2，羅秋華1

(1.河北省邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056000；2.河北省人民醫院，河北 石家莊 050000；3.河北醫科大學第四醫院，河北 石家莊 050000)

目的 探討氧自由基損害和血管內皮功能失調與高血壓發生的關系及不同劑量的瑞舒伐他汀對氧化應激及內皮功能的影響。方法 將8只Wistar-Kyoto大鼠(WKY)作為正常對照組；32只自發性高血壓大鼠(SHR)隨機分為瑞舒伐他汀3.125 mg/(kg·d)組(T1組)、瑞舒伐他汀6.25 mg/(kg·d)組(T2組)、瑞舒伐他汀12.5 mg/(kg·d)組(T3組)和SHR組，每組8只。各給藥組分別給予相應劑量瑞舒伐他汀加蒸餾水1 mL灌胃，SHR組及WKY組給予相同容積的蒸餾水，共喂藥4周。喂藥前后測量各組大鼠血壓。4周后，麻醉后抽取血液，檢測血液中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、內皮素(ET)水平。結果 SHR組血液SOD活力、NO含量明顯低于正常對照組，T1組、T2組、T3組明顯高于SHR組。SHR組血液MDA含量、ET-1的表達明顯高于正常對照組，T1組、T2組、T3組明顯低于SHR組。結論SHR大鼠存在著氧化應激反應的增強和血管內皮功能損害，瑞舒伐他汀可以改善內皮功能。

自發性高血壓大鼠；內皮功能；氧化應激反應；一氧化氮；內皮素；瑞舒伐他汀

高血壓是常見的心血管疾病，嚴重危害人類健康，常引起嚴重的心、腦、腎等并發癥。其病因復雜，病程長，發病機制涉及體內多個系統，其主要危害在于通過增加動脈粥樣硬化病變的發病風險，進而導致心腦腎等重要器官發生缺血性功能與結構損害。氧化應激和內皮功能失調與高血壓的發生、發展、轉歸有密切關系，高血壓時，體內氧自由基增多，而超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，體內脂質過氧化作用增強，進而損傷組織和細胞，造成血管內皮功能障礙，使一氧化氮(NO)合成釋放不足，內皮素(ET)合成釋放增加，使血管收縮，血壓增高[1]。而血壓增高可進一步加重內皮損傷，加劇內皮功能障礙，由此形成惡性循環。因此，高血壓患者除應積極控制血壓外，還應重視氧自由基的清除，減少脂質過氧化作用，改善內皮功能，以減少高血壓患者臨床終點事件[2]。本實驗通過檢測自發性高血壓大鼠(SHR)血液中SOD、丙二醛(MDA)、NO、ET的變化，以探討氧自由基損害和血管內皮功能失調與高血壓發生的關系；通過應用不同劑量的瑞舒伐他汀干預后了解上述指標的變化，探討其對氧化應激及內皮功能的影響及可能的機制，進而為臨床治療提供實驗依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 雄性清潔級Wistar-Kyoto(WKY)大鼠8只，購自河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：DK1009-0005；雄性清潔級SHR大鼠32只，購自北京維通利華動物中心，動物合格證號：SCXK(京)2010-0005，常規飼養于河北省人民醫院動物中心，自由進食，室溫維持在(22±2)℃。本試驗的環境條件符合中國國家標準《實驗動物環境及設施》(GB14925-2001)對動物實驗設施的有關標準，動物飼養管理和動物實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》等法規的要求，并經醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑 SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所，變異系數CV=1.7%。MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，變異系數CV=1.5%。NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批內變異系數<3.8%，批間變異系數<6.8%。ET水平測定所需試劑多聚賴氨酸、一抗(ET-1河北博海生物工程開發有限公司分裝美國SANTA CRUZ公司產品)，SP、Dab(購自河北博海生物工程開發有限公司)。變異系數CV=1.5%。

1.3 分組 將8只WKY大鼠作為正常對照組，體質量250～280 g,血壓(108.07±2.11)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。將SHR大鼠隨機分為瑞舒伐他汀3.125 mg/(kg·d)組(T1組)、瑞舒伐他汀6.25 mg/(kg·d)組(T2組)、瑞舒伐他汀12.5mg/(kg·d)組(T3組)及SHR組，每組8只，體質量240～270 g，各組間體質量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

1.4 給藥方法 各組大鼠適應性飼養2周后，T1、T2、T3組于16：00分別給予瑞舒伐他汀3.125 mg/(kg·d)、6.25 mg/(kg·d)、12.5 mg/(kg·d)加蒸餾水1 mL灌胃，SHR組及正常對照組給予相同容積的蒸餾水，共喂藥4周。

1.5 大鼠血壓的測定 實驗前及喂藥結束3 d后采用中日友好醫院生產的RBP-1B型光電法鼠尾血壓測定儀測定大鼠的尾動脈血壓。測量血壓前將大鼠置于38～40 ℃溫箱內預熱10～20 min，使鼠尾部動脈充分擴張，用尾箍代替袖帶，后接一換能器，連接脈沖感受器，待大鼠適應環境、行為穩定后，打開主機電源。調整脈沖感受器的高度及位置，當聽到規律聲音時，反復擠捏氣球，向尾套內充氣，直至容積脈搏波動消失，再緩慢放氣，當再次聽到規律聲音時，此時血壓表指針所指的刻度為鼠尾動脈收縮壓，連續測3次，每次間隔1 min，以均值作為收縮壓值。

1.6 標本的收集及檢測 喂藥結束3d后，10%水合氯醛(0.5 mL/100 g)腹腔注射，待動物麻醉后迅速開胸，暴露心臟，10 mL注射器抽取心室內血液。取血2 mL迅速注入放在冷水浴冷卻盛有10%依地酸二鈉30 μL、抑肽酶40 μL的Eppendorf管中,輕輕顛倒混勻，低溫離心，3 000 r/min 10 min，留取血漿，-20 ℃保存用于檢測血ET(放免法)。另取血6 mL緩慢置入試管中，室溫下靜置15 min后低溫離心，3 000 r/min 10 min，留取血清，-20 ℃保存用于檢測SOD、MDA、NO(比色法)。所有標本同批檢測，嚴格按說明書操作。

2 結 果

2.1各組大鼠收縮壓水平比較 給藥前，SHR組、T1組、T2組、T3組收縮壓均高于正常對照組(P均<0.05)，SHR組、T1組、T2組、T3組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。藥物干預4周后，正常對照組、SHR組大鼠收縮壓略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；T2組、T3組均較干預前明顯下降(P均<0.05)。給藥后T1組、T2組、T3組收縮壓均低于SHR組(P均<0.05)。T1組、T2組、T3組組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血壓比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與基礎血壓比較，P<0.05；③與SHR組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠血液SOD、MDA、NO、ET-1水平比較 SHR組SOD活力和NO水平明顯低于正常對照組(P均<0.05)，MDA及ET-1水平明顯高于正常對照組(P均<0.05)。T1組、T2組、T3組血SOD活力和NO水平明顯高于SHR組(P均<0.05)，MDA及ET-1水平明顯低于SHR組(P均<0.05)，且T1組、T2組、T3組逐漸增高或降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血液中SOD、MDA、 NO、 ET-1水平比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與SHR組比較，P<0.05；③與T1組比較，P<0.05；④與T2組比較，P<0.05。

3 討 論

近年研究證實，氧化應激反應廣泛存在于高血壓、動脈粥樣硬化以及內皮功能障礙的患者中[3]。氧化應激是體內自由基及其相關物質過量聚集的一種狀態。生物體內的自由基主要為氧自由基(OFR)，包括超氧化物自由基(O2-)、羥自由基(OH·)、過氧化氫(H2O2)、單線氧(1O2)、脂質過氧自由基(RO2-)、脂質過氧化物(ROOH)等，統稱為活性氧(ROS)。體內抗氧化系統包括SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及抗氧化劑維生素A、維生素C、維生素E、谷胱甘肽。ROS生成過多或抗氧化機制減弱都將導致氧化應激狀態[2]。

目前研究認為，氧化應激可能通過以下途徑參與高血壓病的發生、發展：①ROS增多使血管內皮NO合成減少或降解增加，導致血管舒張功能下降，破壞血管自身血壓穩定機制，血壓升高[2，4-5]。②刺激血管內皮縮血管物質釋放。超氧陰離子可激活前列腺素H2/血栓素A2受體，使前列腺素H2和血栓素A2增加，它們屬于環氧化酶源性內皮依賴性收縮因子。超氧陰離子也可通過氧化低密度脂蛋白刺激血管ET釋放[2，4-6]。ET是強烈的縮血管因子，并能促進血管緊張素Ⅱ、醛固酮分泌。③參與血管平滑肌細胞增殖。由還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶誘發的超氧陰離子和過氧化氫促進血管緊張素Ⅱ介導的血管平滑肌細胞增殖，參與高血壓發病環節。ROS可通過氧化低密度脂蛋白刺激血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體表達，也可通過刺激ET釋放，使血管緊張素Ⅱ合成增加，從而促進血管平滑肌細胞增殖[4，6]。④ROS增加細胞內鈣離子內流。ROS造成血管內皮細胞鈣離子內流增加和鈣超載，使內皮細胞損傷。ROS可直接作用于鈉離子/鈣離子交換蛋白，使之失去胞內鈣離子依賴的調節，進而使胞內鈣離子內流增加。ROS還可通過刺激ET、前列腺素H2、血栓素A2生成，激活磷脂酶C-酰基甘油-蛋白激酶C途徑，促進血管平滑肌鈣離子內流，引起血管平滑肌張力增加[7]。⑤促進黏附分子表達。ROS通過激活核轉錄因子誘使內皮細胞表達細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，ICAM-1介導中性粒細胞與內皮細胞黏附及穿出血管壁。ICAM-1表達增加，使中性粒細胞黏附功能加強，黏附于內皮細胞的中性粒細胞激活產生ROS及血管活性物質白三烯、血小板激活因子等，加重內皮細胞損傷，促進高血壓的發生、發展[2，5]。本研究結果顯示，SHR組心肌組織SOD活力下降，MDA含量增高，提示高血壓狀態時體內ROS增多，氧化應激增強；血液中ET含量增高，NO濃度降低，提示高血壓狀態時血管內皮舒張功能減退，內皮功能障礙可能參與高血壓的發生、發展過程，進一步論證了上述觀點。

研究表明，各種血管細胞都可產生ROS，ROS過多造成細胞和組織過氧化損傷[6-7]。許多基礎和臨床實驗發現：在原發性高血壓，血管中ROS水平升高，血管內皮NO生成減少或降解增加，或生物利用度降低[8-11]，均可促使ET[12]、血管緊張素Ⅱ進一步升高[13]，使血管內皮依賴性舒張功能減退，而內皮依賴性收縮功能增強，促進血管平滑肌細胞增殖、肥大，導致血管結構和功能改變。因而在非血流動力學調節障礙的高血壓機制中，內皮-NO-一氧化應激鏈成為討論的焦點之一[1]。此外，在一些動物和臨床實驗中，人們用鈣拮抗劑[14]、第三代β受體阻斷劑[15]、血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體拮抗劑[16]、SOD模擬物[17]、維生素C[18]、維生素E[19]治療原發性高血壓，它們發現通過清除ROS，減少過氧化損傷，增加NO生成，減少ET，可逆轉和改善血管內皮功能障礙，從而提出了高血壓治療中的抗氧化問題。本研究發現，瑞舒伐他汀能顯著降低SHR大鼠心肌組織ET、MDA水平，增加心肌組織NO、SOD水平，提示瑞舒伐他汀可以改善血管內皮功能，可以減少體內氧化應激反應，此結果與上述研究發現相一致。

他汀類藥物是近年研究熱點。他汀類藥物即3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一類可有效降低總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇的藥物。然而他汀類藥物還具有不依賴于調脂作用的有益功效，如改善內皮功能，抑制炎癥反應，抗氧化應激，抑制平滑肌細胞的增殖與促進平滑肌細胞的凋亡，穩定動脈粥樣斑塊，抑制血小板聚集等。大量基礎與臨床研究表明，他汀類藥物可以通過其調脂作用以及多種調脂以外途徑對心血管系統發揮有益影響，其中抑制氧化應激反應是近年來最受關注的他汀類藥物的非調脂作用。ALLHAT-LIT與ASCOT等大規模臨床試驗證實，高血壓患者聯合應用降壓藥物與他汀類藥物，可以更為顯著地降低心血管事件的發生率和病死率[20]。由于他汀類藥物可以通過減少NO降解、增加NO合成、抑制氧化應激反應等機制有效改善血管內皮功能，因此可能對血壓水平具有一定影響。本研究發現，瑞舒伐他汀干預各組血壓均顯著降低，并且其降壓作用呈劑量相關性。進一步證實了他汀類藥物可能具有一定降壓作用。雖然與常用降壓藥物相比他汀類藥物降壓幅度較小，但大量循證醫學試驗顯示，即便輕微的血壓下降就可以顯著降低腦卒中及/或冠心病事件的危險性。

本研究是一小樣本量的觀察，對于他汀類藥物對人的血壓的影響及機制還需進一步觀察和研究，相信隨著相關研究的逐漸深入，對于他汀類藥物的作用會有進一步的認識。

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Changes of SOD,MDA,NO,ET from blood of spontaneously hypertensive rats,and the influence after rosuvastatin intervention

YAN Hongjuan1,XIE Yuetao2,LIU Guang3,YU Mingyue2,BIAN Shuhuai2,LUO Qiuhua1

(1.The First Hospital of Handan，Handan 056000,Hebei,China；2.HeBei General Hospital，Shijiazhuang 050000,Hebei,China；3.The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,Hebei,China)

Objective It is to explore the relationship of oxygen free radical damage and endothelial dysfunction occurs with hypertension,and to explore the effect of different doses of rosuvastatin on hypertension oxidatie stress and endothelial function.Methods Eight Wistar-Kyoto rats (WKY) were designated as normal control group(group N),and thirty-two spontaneously hypertensive rats (SHR) were randomly divided into four groups,which were designated as rosuvastatin 3.125 mg/(kg·d) group (group T1),rosuvastatin 6.25 mg/(kg·d) group (group T2),rosuvastatin 12.5 mg/(kg·d) group (group T3) and SHR control group (group H).Each group had 8 rats.Every medication group was given the respective dose of rosuvastatin+1 mL normal saline by gavage,and the control groups were given the same volume of tap water.All the rats were treated for 4 weeks.The blood pressure was measured by means of a noninvasive tail-cuff method before and after the 4-week treatment.In 4 weeks,blood of the rats was drew after anesthesia to determined the levels of superoxide dismutase (SOD),malonaldehyde (MDA),nitric oxide (NO) and endothelin (ET).Results Compared with group N，the activity of SOD,the level of NO from blood were significantly lower in group H，the indexes were higher in group T1,group T2,group T3 compared with group H.Compared with group N,the level of MDA,ET-1 were significantly higher in group H,the indexes were lower in group T1,group T2,group T3 compared with group H.Conclusion SHR rats have enhanced oxidative stress and damaged vascular endothelialfunction,rosuvastatin can improve their endothelial function.

spontaneously hypertensive rat; endothelial function; oxidative stress; nitric oxide; endothelin; rosuvastatin

閆洪娟，女，碩士研究生，主治醫師，研究方向為高血壓的診治。

邊樹懷，E-mail：yy021223@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.16.006

R-332

A

1008-8849(2015)16-1727-04

2015-01-10