控制性超排卵對(duì)胚胎植入前小鼠子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

周文靜 馮穎 沈蓉蓉 費(fèi)小陽(yáng)

控制性超排卵對(duì)胚胎植入前小鼠子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

周文靜 馮穎 沈蓉蓉 費(fèi)小陽(yáng)

目的 研究控制性超排卵（COH）對(duì)胚胎植入前小鼠子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討體外受精-胚胎移植時(shí)子宮內(nèi)膜容受性的生物學(xué)標(biāo)志物。方法 將12只ICR雌性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組采取促排卵措施，對(duì)照組未作任何處理。通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)研究COH對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組蛋白電泳圖譜與對(duì)照組有明顯差異，2倍以上差異表達(dá)蛋白總數(shù)為89個(gè)。截取其中16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，檢測(cè)出9種有意義的差異表達(dá)蛋白。結(jié)論 COH可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜多種蛋白質(zhì)表達(dá)改變，通過(guò)篩選子宮內(nèi)膜容受性的生物學(xué)標(biāo)志物，可以為提高COH周期的胚胎種植率和妊娠率提供理論依據(jù)。

胚胎植入 控制性超排卵 子宮內(nèi)膜 小鼠

子宮內(nèi)膜容受性是決定胚胎著床的關(guān)鍵因素?？刂菩猿怕眩╟ontrolled ovarian hyperstimulation，COH）周期是使用大量促性腺激素，引起多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，使機(jī)體出現(xiàn)雌激素水平異常升高以及雌孕激素比例失調(diào)。這些激素水平的改變可能影響子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受性，最終導(dǎo)致妊娠失敗。這可能是由于子宮內(nèi)膜中一些基因發(fā)生差異表達(dá)，從而導(dǎo)致激素、細(xì)胞因子、黏附分子及糖蛋白等多種蛋白分子的表達(dá)發(fā)生顯著性改變[1-2]。為了解自然狀態(tài)與超排卵狀態(tài)下胚胎植入前小鼠子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)差異及可能導(dǎo)致的妊娠結(jié)局，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，應(yīng)用雙向電泳、免疫印跡和質(zhì)譜分析技術(shù)分析兩種狀態(tài)下主要差異蛋白，以期為體外受精-胚胎移植研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料 12只均為6周齡的健康雌性ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組小鼠體重（25.4±2.8）g，對(duì)照組小鼠體重（26.3±3.0）g，兩組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射孕馬血清（PMSG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，50IU/0.2ml）10 IU/只，48h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，50IU/0.2ml）10 IU/只。對(duì)照組不作任何處理。注射HCG后第2天同時(shí)處死兩組小鼠，取出子宮；用眼科鑷夾住單側(cè)子宮角，用彎頭鑷從近輸卵管端向子宮頸方向擠壓滾動(dòng)獲取子宮內(nèi)膜；4℃的0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗組織，濾紙吸干后分裝至EP管并置于液氮罐中保存。

1.2 蛋白提取及定量 將冷凍的內(nèi)膜組織取出并充分研磨，加入裂解液，30℃恒溫水浴1h以充分溶解蛋白；15 000g離心15min，收集上清液；將收集的上清液再次離心以充分去除不溶性雜質(zhì)，獲取子宮內(nèi)膜組織的蛋白提取液；采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.3 雙向電泳分離 對(duì)蛋白提取液進(jìn)行等電聚焦電泳和十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，每組3次重復(fù)上樣檢測(cè)。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。染色后的凝膠應(yīng)用Image Scanner掃描儀進(jìn)行掃描，采用PDquest8.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，包括凝膠蛋白點(diǎn)檢測(cè)、圖像背景扣除、蛋白點(diǎn)灰度值標(biāo)準(zhǔn)化、不同凝膠間蛋白點(diǎn)匹配。比較兩組的雙向電泳圖片進(jìn)行，以變化倍數(shù)＞2倍且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白。

1.4 質(zhì)譜分析 將凝膠上切取的蛋白點(diǎn)進(jìn)行漂洗、考染、酶解、萃取、凍干、加入基質(zhì)和質(zhì)譜靶點(diǎn)樣等操作；使用ABI5800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜點(diǎn)靶鑒定；根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 蛋白雙向電泳圖譜分析 兩組的電泳圖譜均有很好的重復(fù)性，圖譜大體一致，小鼠子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì)分子量主要集中在14.4~116 kDa，等電點(diǎn)主要分布在pH 4.0~9.0。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，2倍以上差異表達(dá)蛋白總數(shù)為89個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)75個(gè)，下調(diào)表達(dá)14個(gè)。兩組小鼠子宮內(nèi)膜蛋白電泳圖譜及差異蛋白標(biāo)注見圖1。

圖1 兩組小鼠子宮內(nèi)膜蛋白電泳圖譜及差異蛋白標(biāo)注（a：實(shí)驗(yàn)組；b：對(duì)照組）

2.2 差異蛋白質(zhì)譜分析 從89個(gè)差異蛋白中選取16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，經(jīng)過(guò)查找和確認(rèn)，其中7個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)均鑒定為血清蛋白干擾，共檢測(cè)出9種有意義的差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白8個(gè)，下調(diào)蛋白1個(gè)，詳見表1。

表1 9種有意義的差異蛋白

3 討論

體外授精-胚胎移植的胚胎種植率目前仍停留在低水平，據(jù)統(tǒng)計(jì)由于子宮內(nèi)膜容受性原因?qū)е碌闹彩≌?/3左右，大大限制了輔助生育技術(shù)的成功率[2]。評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜-胚胎發(fā)育同步與否和篩選其標(biāo)志物指導(dǎo)臨床選擇胚胎移植時(shí)機(jī)，是提高妊娠率的研究方向之一。

有研究表明不孕癥人群與正常生育人群的子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)存在一定的差異[3]，這說(shuō)明功能蛋白在子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)中起著重要作用。在體外授精－胚胎移植的過(guò)程中，促排卵藥物的使用，對(duì)子宮內(nèi)膜的容受性造成一定的影響，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育不同步，影響胚胎著床[3]。譚真等[4]通過(guò)比較自然周期胚胎植入窗口前期和植入窗口期的子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)存在差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)共31個(gè)，其中17個(gè)上調(diào)表達(dá)，14個(gè)下調(diào)表達(dá)。涉及到細(xì)胞遷移與融合、酶活性改變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和凝血纖溶等6個(gè)系統(tǒng)。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞吞飲泡、整合素αVβ3、白血病抑制因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)可以部分地反映子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受性。但至今為止，還未能找到更完整的、能動(dòng)態(tài)反映子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性變化的方法。

本研究中上調(diào)倍數(shù)較高的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶屬于子宮內(nèi)膜的分泌蛋白，在孕激素產(chǎn)生旺盛的黃體細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞均含有，提示其在卵巢合成甾體激素,特別是孕酮的產(chǎn)生過(guò)程中起重要作用。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶還與細(xì)胞的凋亡調(diào)控有關(guān)，可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，幫助內(nèi)膜做好胚胎著床前的準(zhǔn)備。另一上調(diào)倍數(shù)較高的蛋白為視黃醛脫氫酶2，是合成視黃酸所必須的酶,也是啟動(dòng)減數(shù)分裂的關(guān)鍵信號(hào)，可以促進(jìn)卵巢合成視黃酸啟動(dòng)減數(shù)分裂。實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮內(nèi)膜角蛋白，I型細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)是對(duì)照組的3.1倍，在劉倍余等[5]的研究中也發(fā)現(xiàn)胚胎反復(fù)種植失敗的婦女種植窗時(shí)期子宮內(nèi)膜的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)存在異常表達(dá)，這與國(guó)外一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[6]。

本研究結(jié)果中唯一的下調(diào)蛋白是抗胰蛋白酶1-3，在人類子宮內(nèi)膜檢測(cè)證實(shí)α1抗胰蛋白酶是在分泌期和種植窗期高表達(dá)的[7]，說(shuō)明其與子宮內(nèi)膜容受性呈正相關(guān)，α1抗胰蛋白酶可以通過(guò)抑制蛋白酶活性，參與子宮內(nèi)膜微環(huán)境的蛋白水解，可能可以作為子宮內(nèi)膜容受性的生物學(xué)標(biāo)志物，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

長(zhǎng)期以來(lái)，胚胎著床的分子機(jī)制一直都是生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。胚胎著床是由多種因素協(xié)同作用的復(fù)雜過(guò)程，各種因子處在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的各個(gè)結(jié)點(diǎn)上，與其他結(jié)點(diǎn)上的因子相互聯(lián)系，相互制約。其中激素及其它著床因子的相互作用和它們?cè)谂咛ブ舱{(diào)節(jié)鏈中的位置、作用途徑還有待進(jìn)一步探討。如可通過(guò)監(jiān)測(cè)各種生長(zhǎng)因子的水平了解胚胎的發(fā)育情況、著床潛力等，從而使其成為研究胚胎著床機(jī)制的切入點(diǎn)，可為提高COH周期的胚胎種植率和妊娠率提供理論依據(jù)和借鑒。今后可選取其中幾個(gè)差異蛋白進(jìn)行種植窗期在體子宮內(nèi)膜組織表達(dá)的定位和半定量驗(yàn)證，以進(jìn)一步研究探討其在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性方面的作用。

[1] Horcajadas J A,Riesewijk A,Polman J,et al.Effect of controlled ovarian hyperstimulation in IVF on endometrial gene expression profiles[J].Mol Hum Rep rod,2005,11(3):195-205.

[2] Riesewijk A,MartnJ,van Os R,et al.Gene expression profiling of human endometrial receptivity on days LH+2 versus LH+7 by microarray technology[J].Mol Hum Rep rod,2003,9(5):253-264.

[3] Ledee-Bataille N,Lapree-Delage G,Taup in J L,et al.Concen-tration of leukaemia inhibitory factorLIF inuterine flushing Fluid is highly predictive of embryo implantation[J].Hum Reprod, 2002,17(1):213-218.

[4] 譚真,李潔,黎明濤,等."種植窗"時(shí)期人類子宮內(nèi)膜組織差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜的初步研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2012,28(2):201-206.

[5] 劉倍余,李潔,劉明濤,等.反復(fù)種植失敗婦女"種植窗"時(shí)期子宮內(nèi)膜組織的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)的差異表達(dá) [J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2014,23(11): 907-912.

[6] Rai P,Kota V,Sundaram C S,et al.Proteome of human endometrium:Identification of differentially expressed proteins in proliferative and secretory phase endometrium[J].Proteomics Clin Appl,2010,4(1):48-59.

[7] Parmar T,Gadkar-Sable S,Savardekar L,et al.Protein profiling of human endometrial tissues in the midsecretory and prolif-erativephases of the menstrual cycle[J].Fertil Steril,2009,92(3): 1091-1103.

Effect of controlled ovarian hyperstimulation on expression of protein profile in preimplanted endometrium of mice

ZHOU Wenjing，F(xiàn)ENG Ying，SHEN Rongrong，et al.Department of Reproduction,Hangzhou Maternity Hospital，Hangzhou 310009,China

Objective To investigate the effect of controlled ovarian hyperstimulation(COH)on expression of protein profile in preimplanted endometrium of mice.Methods Twelve ICR mice were randomly divided into experimental and control groups, COH was given to mice in experimental group.Differential expression of proteins in preimplanted endometrium was analyzed by using two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE)and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS).Results There were 89 proteins differentially expressed＞2 fold in the endometrium between experimental group and control group.Among 89 differentially expressed proteins 16 were further examined with MALDI-TOF-MS and 9 significantly expressed proteins were found.Conclusion Controlled ovarian stimulation can lead to changes in expression of protein profile on the preimplanted endometrium of mice,and screening of endometrial receptivity markers may facilitate to raise the implantation and pregnancy rate.

Embryo implantation Controlled ovarian hyperstimulation Endometrium Mice

2015-07-08）

（本文編輯：李媚）

浙江省人口計(jì)生委科研項(xiàng)目（JSW 2013-A036）

310009杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心

費(fèi)小陽(yáng)，E-mail：feixy1962@163.com