miRNA-133b在胃癌組織中的表達及臨床意義

武偉 周洪偉 李國蘭 何樺波

miRNA-133b在胃癌組織中的表達及臨床意義

武偉 周洪偉 李國蘭 何樺波

目的 分析miRNA-133b表達水平的改變與胃癌臨床病理特征之間的關系，探討miRNA-133b在胃組織中表達的意義。方法 選擇手術治療的胃癌患者腫瘤組織63例為研究對象，取切緣正常胃黏膜為對照，設計針對miRNA-133b的特異性引物，應用定量PCR方法檢測胃癌組織中miRNA-133b表達水平的變化。結合臨床病理資料對miRNA-133b的表達水平與腫瘤病理類型及臨床病理分期之間的關系進行分析。檢測胃癌細胞株中miRNA-133b的表達水平變化。結果 miRNA-133b在胃癌組織中表達水平明顯低于正常胃黏膜組織[ΔCt：（-6.94±3.319）vs（-4.98±2.846），P＜0.001]。其中45例miRNA-133b下調≥2.0倍，占71%；6例上調≥2.0倍，占10%；12例無明顯變化，占19%。miRNA-133b與腫瘤病理類型、腫瘤TNM分期無明顯相關性（P＞0.05）。與正常胃黏膜細胞相比，在胃癌細胞株中miRNA-133b表達明顯下調（P＜0.05）。 結論 在胃癌組織及胃癌細胞中，miRNA-133b的表達水平均有不同程度的降低，但其下降程度和比例與臨床特征無明顯相關性。miRNA-133b的表達水平下調可能與促進腫瘤細胞增殖有關。

miRNA-133b 胃癌 定量PCR

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球每年胃癌新發病例近百萬，我國每年新發現40萬胃癌患者，占世界胃癌發病人數的42%[1]。探討胃癌的發病機制對胃癌的早期診斷和治療至關重要。近年來，有研究證實了微小RNA（miRNA）在胃癌研究中的重要作用，miRNA是一種內源性單鏈非編碼小RNA，長度約為16～28nt。miRNA在各種生長分化及生理過程中都有廣泛的影響，參與基因組的穩定及后天修飾，調節新陳代謝及腫瘤的發生和轉移[2]，目前已有研究表明miRNAs如 miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-451、miRNA-143及miRNA-145等在胃癌發生、發展過程中發揮著重要的調控作用[3-6]，另外參考胃癌臨床樣本miRNA表達譜芯片檢測結果，我們發現miRNA-133b在胃癌中表達明顯下調[7]。本研究旨在觀察miRNA-133b在胃癌組織和細胞中的表達及其在胃癌發生、發展中的調控作用，以加深對胃癌生物學特點的認識，探尋胃癌預防和治療的新靶點。

1 資料和方法

1．1 一般資料 經杭州師范大學附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者本人或家屬簽署知情同意書，收集我院普外科2012年6月至2014年6月期間經胃癌根治術獲得的新鮮標本共63例，經病理學診斷證實所得標本為胃癌組織。所有患者在手術前均未行放射治療、化學治療等，此次是首次進行胃癌根治術。按美國癌癥聯合會（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）標準分期將胃癌組織分為為Ⅱ期（13例），Ⅲ期（40例），Ⅳ期（10例）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及保存 腫瘤標本取自腫瘤部位，陰性對照標本取自距離腫瘤外緣5cm以外的正常胃黏膜組織。所有標本取下后立即放入液氮中，隨后放在-80℃冰箱中保存。胃上皮細胞株GES-1和胃癌上皮細胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45由本實驗室凍存，采用DMEM培養基，置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養箱中培養。

1.2.2 總RNA提純 按Trizol試劑說明書，采用Trizol一步法提取組織和細胞中總RNA，使用ND-1000紫外/可見光分光光度計進行RNA質量和濃度鑒定。用瓊脂電泳驗證RNA的完整性。提取的RNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱或立即用于逆轉錄。

1.2.3 實時定量PCR檢測 以U6基因作內參，轉錄反應嚴格按照試劑盒說明書操作使用。實時熒光定量PCR儀（Rotor-Gene 3000，Corbett Research，AUS）和PCRmix試劑盒（QPK-201，TOYOBO）檢測目的基因的表達水平。目的基因ΔCt=目的基因Ct值-內參基因的Ct值。引物序列見表1。

表1 miRNA-133b和U6的逆轉錄和PCR擴增引物序列

1.3 miRNA-133b表達水平與臨床資料的相關分析 收集63例胃癌患者的基本人口學資料和相關臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、有無淋巴結轉移等。根據以上資料對病例進行分組，比較miRNA-133b相對表達倍數在不同組間的差異。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以或中位數表示，兩組間比較采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或Friedman M檢驗。

2 結果

2.1 miRNA-133b在人胃癌組織中及胃癌細胞株內表達明顯降低 miRNA-133b在多數胃癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織[ΔCt：（-6.94±3.319）vs（-4.98±2.846），P＜0.001]。其中45例miRNA-133b下調≥2.0倍，占71%；6例上調≥2.0倍，占10%；12例無明顯變化，占19%。此外，分別培養胃癌細胞株和正常胃黏膜細胞，并提取RNA，定量PCR檢測miRNA-133b的表達水平，結果顯示，miRNA-133b在胃癌細胞株內表達水平較胃正常上皮細胞內亦明顯下降。在5個細胞株之間，BGC-823細胞中miRNA-133b表達水平最低，較GES-1細胞下降77．0%，AGS、HGC-27、MKN-28和MKN-45細胞中miRNA-133b表達水平與GES-1細胞比較，分別下降71.5%、68．3%、64．7%和50.8%（圖1），該結果與胃癌組織標本中的檢測結果一致，提示miRNA-133b表達水平與胃癌發生有緊密聯系，miRNA-133b可能在胃癌發生、發展過程中發揮抑癌基因的作用。

圖1 胃癌細胞株中miR-133b表達水平分析

2．2 miRNA-133b表達水平與臨床資料的相關分析 63例胃癌患者中，與Ⅱ期胃癌相比，miRNA-133b表達水平在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中也有較明顯的下降趨勢，但差異無統計學意義，其他特征如年齡、性別、腫瘤大小及病理分型等因素與miRNA-133b的表達水平無關（均P＞0．05），見表2。

3 討論

miRNA-133家族包括miRNA-133a和miRNA-133b兩個成員，miRNA-133a在基因組定位于第18號染色體，而miRNA-133b則定位于第6號染色體。PrimiRNA-133b是一個由119個堿基組成的發夾狀前體，經過Drosha和Dicer酶的剪切，最終變成22nt成熟的miRNA。既往研究提示，miRNA-133a和miRNA-133b在小鼠肌肉發育過程中的表達水平明顯升高，并且可促進其分化成熟[8]，被認為是“肌肉組織特定的miRNA”。然而新近的研究顯示，miRNA-133b在正常人體組織中同樣表達，而正常組織變成惡性腫瘤組織時，其表達水平又發生明顯的改變。如在舌癌、膀胱癌、口腔上皮癌、肺癌、食管癌等[9-14]，miRNA-133b表達水平明顯發生改變，并能影響腫瘤細胞的增殖。本研究中，我們在體內和體外水平對63例胃癌中心組織及配對癌旁正常組織和多個胃癌細胞株中的miRNA-133b進行相關檢測，發現多數胃癌組織中miRNA-133b的表達水平低于癌旁組織。另外，我們檢測了miRNA-133b在胃癌上皮細胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45中的表達水平，結果發現與正常黏膜細胞株GES-1相比，miRNA-133b在胃癌細胞株表達水平也明顯下調。因此，基于以上實驗結果，說明無論在組織水平還是細胞水平，miRNA-133b的下調表達是一個普遍現象。

表2 胃癌病例臨床特征與miR-133b表達水平的相關分析

進一步分析miRNA-133b的表達與胃癌的臨床病理因素的相關性顯示，miRNA-133b的表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及胃癌的分化程度、淋巴結轉移、TNM分期均無明顯統計學相關性。因此在臨床胃癌中，miRNA-133b表達水平下降的程度不能反應腫瘤的生物學行為，它不是一個理想的早期診斷及預測轉移潛能的指標。然而由于本實驗所用標本是近1~3年的手術切除標本，還缺乏長期跟蹤隨訪的研究資料，因此我們尚不能確定miRNA-133b是否與腫瘤患者的預后相關。

本研究表明，miRNA-133b在胃癌組織及細胞中的表達普遍下調，由此可認為miRNA-133b在抑制胃癌發生、發展的某個或某些環節中發揮重要作用；而在胃癌發生、發展過程中的具體作用機制有待進一步研究闡述。

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Expression of miRNA-133b in gastric cancer and its clinical significance

WUWei，ZHOU Hongwei，LI Guolan，et al.Department of General Surgery，Affiliated Hospital,Hangzhou Normal University，Hangzhou 300015,China

miRNA-133b Gastric cance Quantitative real-time PCR

2015-05-26）

（本文編輯：嚴瑋雯）

310015杭州師范大學附屬醫院普外科

【 Abstract】 Objective To investigate the exp ression of miR-133b in gastric cancer and its c linicopathological significance. Methods Sixty three specimens of p rimary gastric cancer and corresponding pericancerous gastric tissue were collected.The level of miRNA-133b was exam ined using quantitative real-time PCR assay(qPCR);the correlation between miRNA-133b level and c linicopathologic features were analyzed.The exp ression ofmiR-133b in 5 human gastric cancer cell lines was also exam ined by qPCR.Results Themean exp ression levelofmiRNA-133b was down-regulated in gastric cancer tissues compared with the ad jacent tissues[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P＜0.001].Among 63 pairs gastric cancer tissues,45 cases showed down-regulation of miRNA-133b＞2 folds,12 cases had no d ifference,6 cases d isp layed up-regulation＞2 folds.No significantassociations were detected between the levelofmiRNA-133b exp ression and TNM stage in gastric cancer(P＞0.05).miRNA-133b was also marked ly down-regulated in gastric cancer cell lines. Conclusion miRNA-133b exp ression is down-regulated in gastric cancer tissue and human gastric cell lines.There is no association of miRNA-133b exp ression w ith TNM staging.