血栓性疾病蛋白質組學的研究進展

劉曉霞，康　婭，劉　聰，倪　艷，岳永花(綜述)，郝旭亮(審校)

(山西省中醫藥研究院中藥方劑研究所，太原 030012)

血栓性疾病蛋白質組學的研究進展

劉曉霞△，康婭，劉聰，倪艷，岳永花(綜述)，郝旭亮※(審校)

(山西省中醫藥研究院中藥方劑研究所，太原 030012)

摘要：血栓性疾病是目前人類死亡的最主要原因之一，由于其發病機制尚未明確，以致病死率居高不下。蛋白質組學技術可以高通量地對比健康、疾病及給藥后蛋白質表達譜的變化，有效地進行疾病標志物及藥物靶點的篩選和鑒定。隨著蛋白質組學研究方法的建立和發展，蛋白質組學技術在動脈血栓、靜脈血栓疾病的診斷、治療等方面發揮越來越重要的作用。該文就血栓性疾病蛋白質組學技術的研究進展予以綜述。

關鍵詞:血栓性疾病；動脈血栓；靜脈血栓；蛋白質組學技術

血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程所引起的疾病，臨床上稱為血栓性疾病，主要包括動脈粥樣硬化血栓、靜脈血栓、外周動脈血栓[1]。由于目前血栓性疾病發病機制尚未明確，因此對其的早期診治還不十分滿意。蛋白質組學技術的應用為血栓性疾病提供了新的診斷方法和治療策略。每一種疾病的發生都是特定蛋白質群體在不同時間和空間出現，并發揮不同作用的結果。從血栓性疾病相關蛋白質的整體、動態、網絡研究探討血栓性疾病發生過程中蛋白質的所有特征性變化，從而更加深入地探索其發病機制，發現新的生物標志物，研發新藥等。現就近年來蛋白質組學在血栓性疾病方面的研究進展予以綜述。

1動脈血栓

動脈血栓形成主要累及心血管、腦血管和外周動脈血管(下肢動脈、腎動脈等)，這些部位的血栓大多是在動脈粥樣硬化斑塊破裂的基礎上形成的，即血管內壁損傷使血小板聚集導致血栓形成，嚴重時可導致心肌梗死、腦梗死和急性下肢缺血、壞死等[1]。

1.1動脈粥樣硬化血栓已有研究證實，氧化應激導致的動脈粥樣硬化與破骨細胞相關受體(osteoclast-associated receptor，OSCAR)密切相關[2]。Goettsch等[3]采用細胞穩定氨基酸同位素標記的蛋白質組學方法對OSCAR的功能進行研究，成功檢測到4975個特征蛋白；OSCAR過表達調節145，沉默調節110，這些蛋白主要參與細胞增殖、炎癥反應和細胞間信號轉導；研究結果表明，血管內皮細胞衍生的OSCAR參與信號轉導及轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)信號通路和單核細胞的黏附。STAT3在血管損傷重構時，能促進上皮細胞再生并增加肺動脈內皮細胞的抗凋亡活性[4]，抑制內皮細胞功能障礙和長期攝入酒精后引起的炎癥[5]，即激活OSCAR所產生的抗動脈粥樣硬化作用可能通過調節STAT3的激活發揮作用。de la Cuesta等[6]采用激光顯微切割分離內膜，通過差異熒光凝膠電泳分析比較粥樣硬化前后的冠狀動脈和橈動脈，結果發現，有13個蛋白表達發生變化(7個蛋白表達上調，6個下調)，這些差異表達蛋白涉及血管平滑肌細胞的遷移能力、細胞外基質成分、固縮、凋亡、熱激反應和內部斑塊出血沉積等，說明動脈血管內膜的蛋白變化可以作為早期診斷動脈粥樣硬化的依據。早在2008年，Arias-Salgado等[7]進行了動脈血栓和缺血性動脈血栓患者血小板蛋白質組學的研究，結果顯示，大多數差異蛋白與細胞骨架的改變有關，其中患者血小板蛋白質組中有3個蛋白表達減少，4個蛋白表達增加。Banfi等[8]采用雙向電泳結合質譜技術，研究冠狀動脈疾病血小板蛋白質的表達差異，發現了能量代謝蛋白(lactate dehydrogenase、2-OXO-glutarate dehydrogenase)、細胞支架(lambda actin、coronin 1β、PPpieckstrin)和蛋白降解(psb8)共6個差異蛋白。Moxon等[9]采用二維電泳和免疫印跡的方法對動脈血栓的血小板蛋白進行研究，結果發現，整合素連接激酶、果糖二磷酸醛縮酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在動脈血栓患者血小板中表達減少，肌動蛋白結合蛋白、p57、非肌層肌球蛋白重鏈、M2丙酮酸激酶同工酶、磷酸甘油酸激酶表達增加，這些蛋白與細胞骨架組織的穩定性和蛋白水解的增加有關，提示這些蛋白變化可能與冠狀動脈疾病的發生、發展過程密切相關。

1.3腦梗死有學者采用表面增強激光解吸飛行時間質譜及蛋白質芯片技術對腦梗死患者與健康對照者的血漿蛋白質進行比較研究，實驗中以發現的13個潛在標志物組成的血漿蛋白質譜為診斷模型,可很好地區分腦梗死組與正常對照組，具有較高的敏感性和特異性；其中由質荷比分別為2667，5914及6890的3個潛在標志物所組成的診斷模型,能100%區分急性腦梗死患者與正常對照者，為急性血栓性疾病的標志物研究奠定了基礎[12-13]。

2靜脈血栓栓塞

靜脈血栓栓塞包括深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)和肺栓塞。由于早期臨床表現少，靜脈血栓栓塞的發病率很高，而發現率非常低，往往會導致嚴重的后果。

2.1DVTFlores-Nascimento等[14]利用強陽離子柱分離和電噴霧質譜技術，研究自發近端靜脈血栓患者與健康者的血漿蛋白表達差異，發現患者血漿蛋白中含有C4a血漿蛋白酶(參與炎癥和免疫反應，有可能參與DVT過程)、間α胰蛋白酶抑制劑(與DVT患者炎性狀態有關)、重鏈H抑制劑和血清淀粉酶A(在有炎癥反應時比正常情況增加1000倍，導致炎性因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素1和白細胞介素6增加)。鄧晉京[15]采用雙向電泳和質譜技術分析比較大鼠肢體創傷后血栓形成組和無血栓組血清中蛋白質組的變化情況，發現并鑒定出7個差異蛋白，即補體因子B、視黃醇結合蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶3前體、補體C4、補體因子C3、A鏈大鼠甲狀腺素和α-2U球蛋白前體。姚黎清[16]用雙向凝膠電泳及酶聯免疫吸附等技術研究大鼠股靜脈血管壁組織和人血液中的血栓性蛋白,發現白細胞介素1β、白細胞介素6、分析組織蛋白酶D、分析組織蛋白酶G、α2巨球蛋白表達上調與DVT形成高度相關。這些蛋白可能為DVT及其并發癥的診斷提供一定的依據。為了研究微粒與血栓疾病的關系，Ramacciotti等[17]采用同位素絕對與相對定量聯合雙向電泳-液相-質譜/質譜技術對DVT微粒的蛋白質組進行研究，發現在DVT患者血漿中半乳糖凝集素3結合蛋白、α2巨球蛋白表達增加，而包括纖維蛋白原β和γ鏈前體的9種蛋白表達明顯減少。這些蛋白可能通過放大炎癥反應、微粒生成、抑制纖維蛋白溶解影響血栓形成。Diaz等[18]也發現，半乳凝集素3結合蛋白在DVT微粒中高表達，且P選擇素與DVT的形成密切相關。Piersma等[19]采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結合液質聯用技術對血小板來源顆粒及細胞微粒蛋白質組進行研究，共鑒定出716種可能參與腫瘤侵襲、血管重構等重要過程的蛋白質，如胸苷磷酸化酶和玻連蛋白都是促進血管生成的蛋白質，血管生成素1能促進血管內皮細胞增殖，為其Tie-2受體的特異性配體。可見，血小板來源細胞微粒可能參與炎癥過程、血栓形成、動脈粥樣硬化等過程[20]。

2.2肺栓塞李圣青[21]采用大鼠急性肺栓塞模型,利用雙向電泳技術串聯生物質譜鑒定技術,尋找肺栓塞前后肺組織和血清中差異表達蛋白,應用圖像分析得到的46個差異表達蛋白中有32個得到鑒定,它們分別與肺組織的血管和氣道平滑肌收縮、肺組織內膠原代謝、組織細胞損傷、毒性物質代謝、血壓調節、紅細胞的分化、有氧代謝、維持機體酸堿平衡密切相關。這些差異表達蛋白分子的鑒定為進一步明確肺栓塞病理生理變化的分子機制奠定了基礎。Watts等[22]應用一維電泳和超高效液相色譜串聯質譜技術對肺栓塞后的微粒蛋白進行研究，發現纖連蛋白前體、纖維蛋白原α，β、γ血管假性血友病因子和一些巨噬蛋白在肺栓塞后的微粒蛋白中高表達，觸珠蛋白前體蛋白低表達。這些發現更進一步說明了肺栓塞與微粒蛋白的特征變化關系。這些特征蛋白也許可以作為肺栓塞的早期標志物，也可能成為治療的新靶點。

3蛋白質組學在血栓性疾病的應用前景

應用蛋白質組學技術可以發現生理和病理狀態下血栓性疾病導致的蛋白變化，從細胞分子水平上闡明血栓性疾病的發病機制，為疾病治療和新藥研發提供新的手段和思路。盡管現在很多血栓性疾病特征性蛋白的發現，為臨床診斷、治療帶來了希望，但是，這些特異性蛋白要真正成為血栓性疾病的臨床診斷指標還需要經過漫長的臨床驗證過程。隨著蛋白質組學技術的進步,修飾蛋白質組學、亞細胞蛋白質組學等在血栓性疾病中的廣泛應用，血栓性疾病研究的深入和臨床驗證工作的進一步開展，相信會有高特異性、高敏感性蛋白應用于臨床，為重大疾病發病機制的探討、疾病診斷和治療、鑒別分期及藥物治療監測等提供幫助[23]。現在，應用蛋白質組學技術發現的蛋白靶點與單克隆抗體結合用于治療疾病的研究已經展開[24-25]。

4小結

隨著基因組測序的完成，蛋白質組學熱浪掀起了后基因組時代的序幕，也逐漸成為研究者研究各類疾病的關鍵方法。隨著蛋白質組學技術的進步以及在血栓性疾病中的廣泛應用，血栓性疾病的發病機制將得到更深入的了解，并可能從蛋白質水平找到干預疾病發生和發展的新途徑，為臨床早期診斷和用藥提供依據。蛋白質組學技術的廣泛應用將為血栓性疾病的治療開拓一個全新的領域。

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Progress of Research into Proteomics of Thrombotic Disease

LIUXiao-xia,KANGYa,LIUCong,NIYan,YUEYong-hua,HAOXu-liang.

(ResearchInstituteofMateriaMedicaFormulas，TraditionalChineseMedicineInstituteofShanxiProvince，Taiyuan030012，China)

Abstract:Thrombotic disease is one of the main causes of human death in the world.It has high mortality due to the limitation of the understanding of the pathogenesis.Proteomic techniques can realize high-throughput contrast of the protein expression spectrum between the healthy,ill and postmedication state.It can screen and identify the markers of thrombotic disease efficiently.Along with the establishment and development of proteomics research methods，proteomic techniques are playing an increasingly important role in the diagnosis of arterial thrombosis，venous thrombosis,mechanism and drug treatment.Here is to make a review of the application of proteomic techniques in the research of thrombotic disease.

Key words:Thrombotic disease; Arterial thrombosis； Vein thrombosis； Proteomics technology

收稿日期：2014-08-15修回日期：2014-10-31編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學基金(81274132)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.006

中圖分類號:R543

文獻標識碼:A

文章編號：1006-2084(2015)10-1743-03