基因芯片技術在腎病綜合征研究中的應用前景

張碧麗，郁曉騰

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由于腎小球濾過膜對血漿蛋白的通透性增高、大量血漿蛋白從尿中丟失而導致一系列病理生理改變的臨床綜合征，以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和水腫為主要臨床特點，目前發病機制尚未完全闡明。基因芯片技術是20世紀90年代初期發展起來的綜合了分子生物學、半導體微電子技術、激光化學、計算機科學等眾多學科的一門高新技術，其依據核酸分子雜交原理檢測待測樣品的基因序列及表達的信息，具有高通量、集成化、微型化及自動化的特點[1-2]。目前基因芯片已經發展出多種類型，如Oligo芯片、mRNA表達譜芯片、microRNA芯片、cDNA芯片及DNA甲基化芯片等，涉及基因表達檢測、藥物靶點篩選、新基因識別及基因功能研究等眾多研究領域。高興等[3]利用基因芯片技術進行多種食源性致病菌的篩查檢測，得出隨機引物PCR聯合基因芯片技術進行食源性致病菌檢測的體系完全可行，為病原細菌高通量篩查提供了新的理論和技術基礎。尹豐等[4]利用基因芯片技術篩選人腦膠質瘤細胞（GSCs）和正常神經干細胞（NSCs）中差異表達的基因，揭示了GSCs和NSCs在mRNA表達水平的差異，由mRNA所控制的轉錄調節網絡對NSCs向GSCs的惡性轉化具有重要影響，為探索腦膠質瘤的發生機制及靶向治療提供了線索。基因芯片技術可以從基因水平分析NS的致病機制和藥物治療的作用靶點。本文主要對基因芯片技術在NS中的研究應用進行綜述。

1 基因芯片技術的原理及與高通量測序技術的比較

基因芯片技術的具體程序是把大量已知基因序列探針集成于同一張芯片，將經過標記后的靶核苷酸序列與之雜交，通過檢測雜交信號，對待測樣品中的基因信息進行高通量的分析[5]。高通量測序技術是近年來發展起來的另外一種高通量基因組學研究方法，也稱其為深度測序技術[6]。與高通量測序技術比較，基因芯片技術具有技術穩定、雜交結果分析直觀、快速等優點，其缺點在于基因芯片技術只能檢測已知序列的特征，沒有發現新信息的能力。近幾年發展起來的Target-sequencing或者稱為序列捕獲技術，先利用芯片探針捕獲待測片段，再用深度測序技術分析核酸序列，充分綜合了兩者的優勢，解決了單一技術難以解決的問題[7-8]。

2 基因芯片技術在NS研究中的應用

目前認為NS的發生是由多基因參與的復雜過程。因此，在探索NS發病機制的過程中，能否將NS相關致病基因作為一個整體進行研究，成為解決這一問題的關鍵。基因芯片技術可實現在mRNA水平上同時平行研究成千乃至上萬條基因的表達關系，為揭示NS的發病機制提供了有力工具。

2.1 基因芯片技術與微小病變性腎病（MCNS） MCNS是兒童NS中最常見的病理類型。有學者認為MCNS是由于免疫細胞的功能障礙，可能導致腎小球致通透性因子的釋放[9]。Komatsuda等[10]利用包含24 446個cDNA的微陣列，檢測2例MCNS患者腎病活動期和緩解期外周血單個核細胞（PBMC）mRNA的表達，發現在腎病活動期有171個功能已知的基因表達發生了上調，其中21個基因編碼的蛋白可參與信號轉導和細胞因子的反應，通過qRT-PCR驗證24例MCNS患者、10例膜性腎病（MN）患者和24例健康對照者，證實MCNS患者PBMC中趨化因子13（CCL13）和半乳糖凝集素相關蛋白（hspc159）的mRNA表達均明顯高于MN患者和健康對照組。大量研究表明，CCL13參與許多炎癥性疾病，其通過與受體結合選擇性趨化炎性細胞并調控關鍵的激活程序，推測其可能與MCNS患者的免疫炎癥反應有關[11]。hspc159屬于凝集素家族，可以調節Th1/Th2細胞因子的平衡，Th1/Th2細胞因子的平衡失調被認為參與了許多自身免疫性疾病，推測hspc159的高表達與MCNS患者Th2細胞為主的免疫反應有關[12]。組蛋白賴氨酸甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，被認為參與了多個生物學過程，組蛋白賴氨酸甲基化模式的異常改變，使得染色質的結構發生改變，可進一步導致失調基因的轉錄和疾病進展。Zhang等[13]采用ChIP-chip試驗方法檢測15例MCNS患者和15例正常對照者PBMC組蛋白H3賴氨酸4甲基化（H3K4me3）后基因表達的變化，發現MCNS組有841個基因表達上調、231個基因表達下調，采用qRT-PCR驗證了表達明顯上調的白細胞介素（IL）-4受體（R）、prkd2基因，與芯片結果一致，揭示了這些基因mRNA的表達和H3K4me3水平呈正相關關系。IL-4R基因編碼IL-4R的α鏈，通過與IL-4結合促進Th2細胞的分化，而prkd2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，其在多種細胞表達，調節包括免疫反應在內的多種細胞反應，并且prkd2對內皮細胞的增殖和遷移起著重要作用，這些顯著變化的基因有助于解釋MCNS患者免疫功能紊亂[14-15]。此外，還發現H3K4me3和MCNS患者啟動子DNA甲基化之間存在負相關關系[13]。Kobayashi等[16]利用DNA甲基化芯片分別檢測6例MCNS患者緩解期、復發期的外周血的單核細胞和Th細胞，結果顯示從緩解期到復發期DNA甲基化模式主要發生在Th細胞，GATA2、PBX4和NYX 3個基因的表達顯著降低，表明表觀遺傳調控Th細胞是MCNS的發生機制。

以上研究表明，T淋巴細胞基因的異常表達導致細胞免疫功能障礙，引發腎小球濾過膜通透性改變，參與了NS的發病。利用基因芯片技術篩選差異性表達基因，并探討各個基因之間的相互關系和作用，是最終闡明NS發病機制和尋找藥物治療靶點的關鍵。

2.2 基因芯片技術與局灶節段性腎小球硬化（FSGS） 近年來，兒童FSGS的發病率一直在增長，是導致兒童慢性腎衰竭的重要原因。研究認為FSGS的發生和足細胞損傷或數目減少有關[17]。足細胞表達許多特殊的蛋白分子，如nephrin、CD2AP、Podacalycin等，這些蛋白的編碼基因突變或缺失可以導致足細胞的結構和功能改變[18-19]。Jeffrey等[20]通過比較FSGS患者、MCNS患者及正常人的基因表達譜變化，發現FSGS組較MCNS組、正常組有316個基因表達發生顯著差異，其中nephrin的表達下降近2倍，足細胞特異性肌動蛋白相關蛋白（Synaptopodin）表達下降近3倍，還有一些構成足細胞裂孔隔膜（SD）復合體的分子，如FAT1、MAGI2和TJP1的表達同樣降低，證實足細胞結構改變與FSGS的發生密切相關。通過聚類分析，揭示這些基因的功能涉及細胞周期與細胞增殖、細胞骨架與運動、細胞信號轉導等多個方面，細胞增殖周期中轉錄因子的再激活和過表達很可能與FSGS發病機制有關[20]。Bennett等[21]研究發現 FSGS患者 NPSH1、WT1、nephrin、ACTN4等足細胞相關基因表達明顯下調，進一步證實足細胞損傷與FCGS發生密切相關。同時有研究證實血管內皮生長因子（VEGF）表達的下降與蛋白尿有關，而轉化生長因子（TGF）-β信號通路表達增強[20]。目前研究證實，TGF-β信號通路表達增強可導致腎臟纖維化的進展[23]。另有研究表明，激素抵抗性腎病綜合征和TGF-β1的表達上調有密切關系[24]。目前TGF-β1已被公認是治療腎小球硬化的靶點。有研究表明血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類藥物可以下調TGF-β1的表達，達到干預FSGS進展的作用[25]。

2.3 基因芯片技術與膜性腎病（MN） MN是成人NS中最常見的病理類型，以基底膜彌漫性增厚及上皮下免疫復合物沉積為特征，其發病機制目前仍不明了。Sui等[26]利用基因芯片技術研究MN與正常人PBMC組蛋白H3賴氨酸9（H3K9me3）甲基化修飾后的變化，發現MN患者有108個基因表達發生了明顯變化，通過qRT-PCR驗證了DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC3、BIRC2 基因表達明顯上調，與芯片結果一致，其中CNTN4編碼黏附蛋白，屬于免疫球蛋白家族的成員。另有研究顯示CNTN4基因表達上調，可能與MN免疫復合物沉積有關[27]，為探討MN的發病機制及治療提供了方向。Wu等[28]以胎齡6周的BALB/c小鼠為研究對象，模型組予以陽離子化的牛血清白蛋白（C-BSA）造成MN，利用基因芯片分別檢測模型組和對照組小鼠腎皮質，結果模型組有175個基因呈顯著差異性表達，從中篩選出4個與損傷、炎癥、細胞基質相互作用有關的基因MT-1、CTSD、lamr-1和LY6進行PCR驗證，與芯片結果一致。其中LY6在以往的研究中被證實和蛋白尿的發生及狼瘡腎損害有關[29]；而CTSD編碼的組織蛋白酶D正常情況下分布于遠端腎小管和集合管系統，其表達增加可見于鏈球菌感染后腎小球腎炎[30]。王琳等[31]利用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0探索特發MN患者全基因組拷貝數變異（CNVS）與參芪膜腎方療效的關系，觀察到參芪膜腎方治療有效組和無效組在第5、6、8號染色體檢測到的CNVS差異有統計學意義，其中位于6號染色體上的HLA族基因在有效組多數病例中表現為拷貝數擴增，而無效組的多數病例則表現為拷貝數缺失，得出基因背景差異可能是導致參芪膜腎方取得不同療效的原因，HLA的同族基因拷貝數變異影響參芪膜腎方療效的發揮，前者有望成為該方治療MN的療效預測因子。

2.4 基因芯片技術與系膜增生性腎小球腎炎 系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是以不同程度的系膜區增寬、系膜細胞增生、系膜基質增多為主要病理特征的腎小球疾病。通過給大鼠靜脈注射單克隆抗Thy-1抗體模擬慢性腎小球腎炎模型，可以觀察到腎小球系膜及系膜細胞的顯著增殖，類似MsPGN[32]。Sadlier等[33]利用Oligo芯片分別檢測注射抗Thy-1抗體后第0、2、5、7、14天大鼠腎皮質基因表達譜，發現在第5天PDGF、TGF-β等促細胞增殖基因的表達顯著增加，通過聚類分析發現了新的促系膜細胞增殖基因S100家族。Tsuji等[34]利用基因芯片技術比較不可逆模型組（靜脈注射1-22-3抗體并切除單側腎臟）、可逆模型組（單純靜脈注射1-22-3抗體）大鼠之間差異表達基因，檢測出有189個基因發生差異表達，而且大多數的差異基因發現于第4天，提示基因表達的早期變化決定了疾病的不可逆性，其中胸腺肽-β10在不可逆組顯著表達，推測腎臟疾病發生的共同機制可能涉及間質纖維化和巨噬細胞浸潤。Hong等[35]通過芯片檢測模型組大鼠在不同時間點基因表達譜的變化來研究DNA結合轉錄因子KLF-15對腎小球系膜細胞的影響，結果表明KLF可能通過調節細胞周期蛋白E2F1的表達抑制腎小球系膜細胞的增殖，其可作為治療系膜增生性腎小球腎炎的一個靶點。

3 問題與展望

基因芯片技術經過近20余年的快速發展，已經成為了一個非常穩定可靠的實驗技術，并展現出其快速性、高效性、準確性的優勢。這一技術在腎臟疾病發生機制的研究及藥物治療靶點的篩選中發揮著重要作用，但仍存在一些問題需要完善，比如，如何降低芯片的成本，如何簡化實驗流程，提高檢測結果的特異性等。隨著研究的深入和這些問題的不斷解決，基因芯片技術將在腎臟疾病的研究中發揮更重要的作用。

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