高吸水性樹脂協同高強度聚焦超聲對細粒棘球絳蚴原頭節細胞酶活性的影響

張 靜，王夢瑩，葉 彬，趙毅峰，韓秀敏，李發琪，王 琦

高吸水性樹脂協同高強度聚焦超聲對細粒棘球絳蚴原頭節細胞酶活性的影響

張 靜1,2，王夢瑩2，葉 彬1,2，趙毅峰3，韓秀敏4，李發琪5，王 琦5

目的 為探索高吸水性樹脂(Super Absorbent Resin，SAR)協同高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)對離體細粒棘球絳蚴原頭節酶活性的影響。方法 將離體原頭節懸液(每mL含有2 000個原頭節)，分為4組：I組(僅原頭節懸液)、Ⅱ組：僅SAR組( 0.01 gSAR)、III組(單純HIFU照射)、IV組(HIFU照射+ 0.01gSAR)、Ⅴ組(HIFU照射+ 0.1 gSAR)。以聲功率為100 w的高強度聚焦超聲波輻照30 s，輻照后懸液涂片進行臺盼蘭及經冰凍切片酶組織化學染色，觀察原頭節形態學改變，并用半定量方法檢測原頭節內細胞的葡萄糖-6-磷酸酶和琥珀酸脫氫酶的活性。結果 顯示當超聲劑量一定時，原頭節的形態改變與SAR劑量有正效應關系，SAR量越大，其破壞程度越高。正常原頭節透亮、外形完整，各實驗組原頭節深染或結構崩解。單純HIFU照射組在作用60 s時，原頭節死亡率為80.1%；HIFU結合不同量SAR兩組原頭節在HIFU作用10 s時，其死亡率分別為87.82%和89.1%。加入SAR后再經過HIFU照射各組原頭節內細胞葡萄糖-6-磷酸酶和琥珀酸脫氫酶活性降低，明顯低于單純超聲組(P<0.05)，陰性對照組無酶反應物產。結論 SAR能增加HIFU輻照對原頭節的急性殺傷作用，使原頭節內細胞的葡萄糖-6-磷酸酶活性和琥珀酸脫氫酶活性均顯著低降低，從而影響其活力。

細粒棘球絳蚴原頭節；高吸水性樹脂；高強度聚焦超聲；三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶；琥珀酸脫氫酶

囊性包蟲病是細粒棘球絳蟲寄生于人和其它動物體內所致的一種嚴重的人畜共患病，呈世界性分布。在我國，該病主要分布于西部、中部、東南以及東北的11個省區[1]。我們的前期試驗證明，高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)對包蟲病有一定的治療作用[2-3]，但由于包蟲病是一種囊性病變，內充囊液，據文獻[4]：99%囊液成分為水分，其余為蛋白質、電解質等，因此一定強度的超聲劑量受囊液的影響而使焦域內能量不能有效聚集，故實驗發現不能將棘球蚴包囊內原頭節全部殺滅，治療效果尚有欠缺。

高吸水性樹脂(Super Absorbent Resin，簡稱SAR)，又稱為超強吸水高分子材料(Super Absorbent Polymer，簡稱SAR)，高吸水性樹脂是上世紀六十年代初期迅速發展起來的一種具有疏松網絡結構的新型功能高分子材料，主要具有水的傳遞、轉換和儲存等功能。與傳統的吸水材料不同的是高吸水性樹脂既不溶于水也難溶于有機溶劑，但與水接觸后，在短時間內溶脹，能吸收自重幾百倍甚至上千倍的水，且吸水速度快，保水性能好，即使在加壓的狀態下也很難脫水，還可反復使用[5]。由此本研究提出在囊液中注入高吸水性樹脂把水分吸收，提高HIFU的能量，本實驗擬利用SAR的超強的吸水能力，使囊液濃縮，提高HIFU作用后其焦域的溫度，殺傷更多的原頭節，因此就SAR增強HIFU對離體原頭蚴效應進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原頭節采集 細粒棘球蚴采自青海省西寧市某屠宰場包蟲感染病羊肝，屠宰后立即冰盒低溫保存送至實驗室。為盡量保持自然狀態，用消毒酒精輕輕擦拭病羊肝表面，在無菌室內，直接從包囊吸出囊液和原頭節，抽吸出的囊液和原頭節分別置于實驗用無菌瓶中，4 ℃冰箱短期保存備用。用0.4%臺盼蘭(trypan blue)染色，檢查原頭節活力，活力超過95%的原頭節用于實驗。

1.1.2 實驗試劑 高吸水性樹脂(SAR，自制)，0.01 mol/L PBS溶液(武漢博士得公司)，0.4%臺盼藍染液(以PBS溶液稀釋、過濾，終濃度為0.4%)，OTC冰凍切片包埋劑(包埋劑為美國SAKURA公司)，滅菌注射用生理鹽水及其他試劑均為國產。

1.2 主要儀器 JC-200型聚焦超聲腫瘤治療系統(簡稱海扶刀)，由重慶醫科大學醫學超聲工程研究所設計制造，青海大學附屬醫院提供。技術參數：超聲換能器的工作頻率為0.8 MHz，焦點聲強范圍0～15000 W/cm2，透鏡焦距為110 mm，連續可調。組合治療頭安裝于盛循環脫氣生理鹽水的容器底部，并可在X、Y、Z 3個方向上隨意運動，聲波由治療頭自下向上發出。普通生物顯微鏡(日本Nikon公司)，掃描電子顯微鏡 S-3000N(日本日立公司)，透射電子顯微鏡 Hitachi-7500(日本日立公司,恒溫箱式冰凍切片機(北京中西遠大科技有限公司)，20 mL無菌注射器若干。

1.3 實驗分組和方法

1.3.1 實驗分組 每管5 mL囊液和10 000個原頭節。實驗分對照組(Ⅰ組：超聲假照且原頭節懸液中不加SAR)、實驗組：SAR半飽和量組(Ⅱ組)、單純HIFU照射組Ⅲ組、HIFU照射+SAR半飽和組(Ⅳ組：SAR為0.01 g)、HIFU照射+SAR飽和組(Ⅴ組：SAR為0.1 g)。

1.3.2 高吸水性樹脂的制備及注射 高吸水性樹脂由本室制備并保存于密閉容器中，置37 ℃恒溫箱內防止吸潮(批號20100727)。將160～180目SAR顆粒與無水酒精混勻制成混懸液待用，用注射器抽吸掉少量囊液減壓后，再將SAR、酒精混懸液注射至盛有原頭節懸液的聚乙烯試管中內，靜置片刻后，用于HIFU照射實驗。

1.3.3 HIFU照射實驗 實驗中超聲波由治療頭自下向上發出，盛裝原頭節懸液的聚乙烯試管固定于治療頭焦域內，通過診斷超聲實時監控，將焦點對準試管內懸液的中心進行定點輻照，采用100W持續照射30 s。照射結束后立即將原頭蚴懸液取出涂片每組涂片3張，在光鏡下觀察原頭節的活動度和0.4%胎盤藍染色檢測原頭節活力，在3 min內，分別計數原頭節死活。

1.3.4 原頭節的急性殺傷作用 每張玻片隨機數200個原頭節，計數其中活原頭節數目。以上每個劑量(功率×時間)設3個平行管，實驗隔天重復1次，共進行5次，取每組活原頭節計數,其平均值作為該組的最終活原頭節計數值。根據式(1-1)計算殺傷率：

1.3.4 H輻照后原頭節的返種實驗 用定點點打方式輻照處理組原頭節懸液，對照組予診斷超聲以假照。HIFU輻照過的原頭節經臺盼藍染色確認為存活狀態后，將原頭節懸液混勻后置于1640培養液中，37 ℃，二氧化碳溫箱培養7 d。接種原頭節量約為1 500個/只。同時以假照之懸液同樣接種作為陽性對照組。計數原頭節死亡率。

1.3.5 冰凍切片制備及染色 載玻片的預處理：以蒸餾水1∶10稀釋0.1%多聚賴氨酸溶液，用前將玻片浸于多聚賴氨酸溶液5分鐘。在60 ℃烘箱干燥1小時備用。分組同前，采用治療聲功率50 W，輻照時間10 s，定點點打方式輻照處理組原頭節懸液，對照組予診斷超聲以假照。照射后輕輕混勻懸液，將試管里自然沉淀的原頭蚴，經0.1 mol/L PBS洗滌3次后，注入OCT液， 立即經液氮驟冷至恒冷箱切片, 制成厚度為7～10 μm 的連續切片。每一指標均觀察原頭蚴切面50～60個，用光學顯微鏡確定原頭蚴體內上述組織化學成分的定位， 并以染色深淺及反應程度來判別其含量及強弱。

1.3.6 對照及結果判定 檢測琥珀酸脫氫酶活性(SDH)采用N-BT法顯示SDH，檢測葡萄糖6-磷酸酶活性(G-6-P)采用硝酸鉛法檢測G-6-P。以正常小鼠腎上腺皮質作為SDH的陽性對照，正常小鼠肝臟作為G-6-P的陽性對照，作用液中不加反應底物結果作為陰性對照。所有切片均在相同的條件下平行操作。SDH活性部位顯藍色，活性較低時顯紫紅色。棕黑色硫化鉛沉淀處為G-6-P酶活性所在部位，光鏡下G-6-P酶反應產物較均勻分布于胞質中。

1.4 統計學分析 采用SPSS 12. 0統計軟件包作數據處理，檢驗水準設定為α=0.05，P<0.01即為差異有統計學意義。即刻殺傷作用的實驗結果測量資料的多因素方差分析，不同因素間兩兩比較用F檢驗。

2 結 果

2.1 對原頭節的殺傷效果 HIFU照射及SAR協同作用于原頭節的急性殺傷作用如圖1。除超聲假照組外， 各組原頭節隨作用時間延長，其死亡率升高，僅有SAR的囊液中原頭節死亡率與空白組差異有統計學意義(P<0.001)，但各時段死亡率明顯低于同一處理時段的單純HIFU照射組(P<0.001)；單純HIFU照射組原頭節死亡率在各作用時間點(5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 seconds)分別為21%, 50.83%, 56,5%, 73.7%, 78%, 80.1%；HIFU 照射(100W+SAR半飽和)組為63.8%、87.82%、89.4%、92.3%、100%、100%、100%；HIFU照射 (100W+SAR飽和)組為68.4%、89.1%、90.6%、93.2%、100%、100%、100%。根據對數據進行ANOVA分析，不同實驗組之間存在統計學差異(F=357.5，P<0.001)，不同作用時間對原頭節的影響具有時間-效應關系，Ⅲ組、Ⅳ組原頭節死亡率在HIFU作用40 s后差異無統計學意義(P>0.01)。

2.2 原頭節形態變化 光鏡觀察HIFU輻照后的各組原頭節：對照組存活的原頭節，能排斥染料而不被染成藍色，內部結構清楚(圖1)。死亡的原頭蚴被臺盼蘭染色后，表現為幾種形式，1)蟲體淺染，大小正常，外形完整，小鉤、吸盤、鈣小體尚清晰；2)蟲體深染，濃縮，小鉤聚集成團，鈣小體消失；3)蟲體已完全解體，碎片藍染，小鉤、鈣小體散落。單純100W HIFU作用后，死亡的原頭節雖被藍染，內部結構仍可辨(圖2)。HIFU+SAR各組可見破裂的蟲體、散落出來的頭鉤、大量鈣小體、及吸水后的SAR顆粒(圖3)。

圖1 對照組活原頭節Fig.1 Alive protoscolices in the control group(×20)

2.3 原頭節內酶反應結果 正常對照組原頭節內顯示深藍色顆粒分布在原頭節的實質細胞內，而小鉤內沒有深藍色顆粒，提示原頭節內SDH酶活性較高(圖4)。而實驗各組(包括加入SAR)原頭節實質細胞內顯示內淺藍色顆粒甚少或缺如，而SAR協同HIFU照射組原頭節內SDH活性顯著降低(圖5～7)。G-6-P染色后，正常對照組原頭節染成金黃色，頭節內茶褐色顆粒沉積(圖8)；HIFU作用各組原頭節內G-6-P顆粒淺染(圖9～11)。

表1 不同SAR協同HIFU照射對原頭節的急性殺傷作用(致死率%)

Tab.1 The death rates of protoscolices in the protoscolices suspension after irritation of HIFU (100W) and HIFU combined with SAR in different exposure times (%) (n=5)

GroupDeathratesofprotoscolicesafterirritationofHIFU(%)Exposureduration(seconds)5102030405060Ⅰ組：空白組(超聲假照)5．01±0．15．22±0．115．29±0．1015．36±0．125．53±0．1116．27±0．1326．73±0．1Ⅱ組：SAR組(半飽和量)5．82±0．126．7±0．1217．0±0．1177．2±0．127．25±0．167．67±0．1128．03±0．106Ⅲ組：HIFU(100W)21±0．11150．83±0．12456．5±0．13668．4±0．1373．7±0．1278±0．14380．1±0Ⅳ組：HIFU(100W+SAR半飽和)63．8±0．1287．82±0．15287．33±0．12789．4±0．11592．3±0．113100±0100±0Ⅴ組：HIFU(100W+SAR飽和)68．4±0．13289．1±0．15890．6±0．10493．2±0．13100±0100±0100±0

Note: there were significant death in the HIFU duration groups comparison with the no duration groups (*P<0.05), in the SAR groups comparison with the simple HIFU group (#P<0.05), in the SAR combined with HIFU groups comparison with the simple HIFU group (#P<0.05); and between the SAR combined with HIFU groups (§P<0.05).

圖2 HIFU單純照射組原頭節

Fig.2 Total death of coloured protoscolices due to exposure to HIFU of 100 W acoustic power for 30 seconds (×10)

圖3 SAR協同HIFU照射組原頭節

Fig.3 The less structures of dead protoscolices (P), super-absorbent resin(S), free hooks (H), calcareous corpuscles (C) after exposure to HIFU of 100 w combined with SAR for 30 seconds (×40)

圖4 對照組原頭節內細胞SDH酶顆粒呈深藍色(×40)

Fig.4 Normal SDH staining in the live protoscolices ofEchinococcusgranulosus(×40)

圖5 HIFU單純照射組照射后原頭節內細胞SDH酶顆粒淺染(×40)

Fig.5 The SDH staining intensity was reduced after exposure to the 100 W acoustic power of HIFU (×40)

3 討 論

原頭蚴在細粒棘球絳蟲的生活史中是非常重要的發育階段，是相對獨立的個體。原頭節不耐高溫，但耐低溫，在-4 ℃冰箱保存可存活幾天，在-20 ℃可存活幾個月[6]，而且原頭節是包蟲囊液中最活躍和最富有生理機能的成分，其功能表現在：1)

圖6 SAR(半飽和組)協同HIFU照射后原頭節內SDH顆粒淺染甚或無色(×40)

Fig.6 The SDH staining intensity was markedly reduced after exposure to the 100 W acoustic power of HIFU (×40)

圖7 SAR(飽和組)協同HIFU照射后原頭節內SDH顆粒淺染甚或無色(×40)

Fig.7 The SDH staining intensity was markedly reduced after exposure to the 100 W acoustic power of HIFU (×40)

圖8 對照組原頭節內細胞G-6-P酶活性強，呈視野呈茶褐色。(×40)

Fig.8 Normal G-6-P staining in the live protoscolices ofEchinococcusgranulosus(×40)

原頭節一旦逸入宿主組織器官，即可繼發包蟲病。2)原頭節具有較高的免疫原性。3)若被終宿主吞入，則可發育為一條成蟲[7]。從形態上來看，原頭節體細胞的類型與生發層上的細胞基本上是一致的[8-9],這種細胞是合胞體結構，似類上皮細胞，屬于未分化的細胞， 有極強的繁殖生長能力[10]。因此，抑制原頭節活性或殺滅原頭節是在包蟲病治療過程中最關鍵的研究內容[11-12]。

圖9 SAR(飽和組)協同HIFU照射后原頭節內SDH顆粒淺染(×40)

Fig.9 The G-6-Pstaining intensity was markedly reduced after exposure to the 100 W acoustic power of HIFU (×40)

圖10 SAR(半飽和組)協同HIFU照射后原頭節內G-6-P顆粒淺染(×40)

Fig.10 The G-6-P staining intensity was markedly reduced after exposure to the 100 W acoustic power of HIFU (×40)

圖11 SAR(飽和組)協同HIFU照射后原頭節內SDH顆粒淺染(×40)

Fig.11 The G-6-P staining intensity was markedly reduced after exposure to the 100 W acoustic power of HIFU (×40)

HIFU已廣泛用于治療臨床上的各種實體腫瘤[13]，尤其對子宮肌瘤的療效非常好[14-18]。其充分利用聲波的聚焦原理，將超聲波能量匯集于機體深部某一靶區，通過超聲波的熱效應、空化效應、機械效應、聲化學效應等使靶區內溫度瞬間達到65 ℃～100 ℃，腫瘤組織產生凝固性壞死[19]發生不可逆破壞，必要時可重復進行，直至病灶全部破壞，從而達到“深部切除”的目的，達到無創治療的效果。

我們的前期研究證明了HIFU治療對棘球蚴有殺傷效果[20]，而對囊內原頭蚴有一定殺滅作用，但效果不盡如人意。主要是因為囊液聚焦性差，同時液體散熱又比較快，使得高強度聚焦超聲波作用后囊液溫度明顯不如囊壁實體組織升得高且快。因此，對囊液的處理和充分發揮HIFU的熱效應在治療包蟲病過程尤為重要和關鍵。從高強度聚焦超聲波對原頭節的急性殺傷效應看，其死亡率與照射劑量及照射時間正相關，HIFU對棘球蚴也有熱效應。本實驗觀察到死亡的原頭蚴被臺盼蘭染色后，表現為幾種形式，集中體現了HIFU對蟲體破壞既有空化效應、機械效應(如原頭節被撕裂成碎片)，也有熱效應(如原頭節蟲體完整，但臺盼蘭染料能滲入皮層細胞)。從原頭節的死亡率看，與SAR量亦有劑量-效應關系，SAR量越大，原頭節死亡率亦有增高，可見加入SAR后，HIFU照射對原頭節的殺傷效果優于不加SAR的單純囊液，提示SAP吸液后，游離水減少，一方面緩沖了液體對熱量的消減作用，使局部組織溫度瞬間上升，導致蛋白變性及組織細胞發生不可逆的凝固性壞死。

本實驗采用冰凍切片(frozen section)的方式來觀察酶的活性，酶組織化學在顯示細胞功能受損方面更直觀。檢測了琥珀酸脫氫酶和葡萄-6-磷酸酶的活性。琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase，簡稱SDH)是脫氫酶中最重要的酶，它存在于所有有氧呼吸的細胞內，和線粒體內膜緊密結合黃素酶類，是線粒體內膜的結合酶，屬膜結合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標志酶。故為三羧酸循環的標志酶，也為線粒體的標志酶[21-22]。細粒棘球絳蟲的原頭節具有完全的三羧酸循環功能[23]，鄒曉毅等證實HIFU作用降低了酶活性，改變原頭節內體細胞功能，干擾細粒棘球絳蟲原頭節營養吸收與代謝，抑制其增殖，對原頭節的殺傷具有一定遲發性效應，能夠抑制輻照后存活的原頭節在體內、外的生長，并可能最終導致寄生蟲死亡[24]。葡萄-6-磷酸酶(G-6-P)定位于內質網網腔和核膜間隙，為內質網的標志酶。G-6-P參加糖代謝，且具有特異性，僅能水解葡萄糖-6-磷酸而釋放出葡萄糖和磷酸，但不能水解葡萄糖-1-磷酸，是糖代謝的關鍵酶，反應細胞有氧代謝及為細胞及蟲體提供能量。

本實驗觀察到，正常原頭節內SDH和G-6-P非常豐富，而鈣小體內G-6-P更多，表現為深棕褐色。當加入SAR后再經過HIFU照射，原頭節內主要酶顏色變淺甚至消失，表明酶活性明顯減弱；鈣小體減少，意味著酶活性消失；頭鉤脫落意味著失去感染終末宿主并寄生在終末宿主腸道的能力，但是在中間宿主體內這些結構也會自然退化，所以對中間宿主而言，最重要的是看原頭蚴體細胞的凋亡與壞死程度。

[1]Yu SH. Global progress of echinococcosis control and an insight to the national control program[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2008, 26(4): 241-244. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7423.2008.04.001 (in Chinese) 余森海. 棘球蚴病防治研究的國際現狀和對我們的啟示[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2008,26(4):241-244.

[2]Zou XY, Wang JA, Zhou QT, et al. Inhibiting effects of high intensity focused ultrasound onEchinococcusgranulosusprotoscolicesinvitro[J]. Chin J Endemiol, 2008, 27(002): 154-157. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-4955. 2008.02.012 (in Chinese) 鄒曉毅, 王俊安, 周潛濤，等. 高強度聚焦超聲波對細粒棘球絳蟲原頭節的殺傷效應[J]. 中國地方病學雜志,2008, 27(002): 154-157.

[3]Wang JA, Zou XY, Ye B, et al. Pathological change in hydatid cysts ofEchinococcusgranulosustreated with high intensity focused ultrasound[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2007,25(6): 461-2-465. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7423.2007.06.006 (in Chinese) 王俊安, 鄒曉毅, 葉彬，等. 高強度聚焦超聲輻照后細粒棘球蚴囊壁的病理變化[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2007, 25(6): 461-2-465.

[4]Xu XP, Wang GL. The harm and prevention and control strategies of hydatid cyst[J]. Xinjiang Farm Res Sci Technol, 2013, 9: 52-55.DOI: 10.3969/j.issn.1001-361X.2013.09.041(in Chinese) 徐雪萍, 王光雷. 棘球蚴病流行危害及防控策略[J]. 新疆農墾科技. 2013,9:52-55.

[5]Long MC, Wang P, Zheng T. Progress in the preparation and application of high water-absorbent resins[J]. Polymer Materials Sci Engineer, 2002,18(5): 31-35. DOI: 10.3321/j.issn:1000-7555.2002.05.007 (in Chinese) 龍明策,王鵬,鄭彤. 高吸水性樹脂的合成及其應用[J]. 高分子材料科學與工程,2002,18(5):31-35.

[6]Galindo M, Schadebrodt G, Galanti N.Echinococcusgranulosus: cellular territories and morphological regions in mature protoscoleces[J]. Exper Parasitol, 2008, 19(4): 524-533.

[7]Yuan LY, Zhang ZZ, Shi BX，et al.Invitrocultivation protoscoleces of the protoslices ofEchinococcusgranulosusin medium RPMI-1640 and MEM[J]. J Anim Sci Vet Med, 2008, 27(5): 16-18. DOI: 10.3969/j.issn.1004-6704.2008.05.005 (in Chinese) 袁麗英, 張壯志, 石保新,等. 細粒棘球絳蟲--原頭蚴在兩種細胞培養液中體外培養的初步觀察[J]. 畜牧獸醫雜志,2008, 27 (5): 16-18.

[8]Shan JY, Kang JF, Akira I. Isolating the body cells of the protoscolices of theEchinococcusgranulosusinvitroand the characteristics of the cell morphology[J]. J Xinjiang Med Univ, 2005, 28(4): 360-363. DOI: 10.3969/j.issn.1009-5551.2005.04.025 (in Chinese) 單驕宇 ，康金鳳, 伊藤亮. 細粒棘球蚴原頭蚴體細胞的分離及其細胞形態特點[J]. 2005, 28(4):360-363.

[9]Xu JB, Sun JG, Yuan H, et al. Experimental study on the growing influence and apoptosis of germinal cells of bone echinococcosis by intensity modulated radiation therapy[J]. J Xinjiang Med Univ, 2014, 7: 821-823. DOI: 10.3969/j.issn.1009-5551.2014.07.002 (in Chinese) 徐江波,孫俊剛,袁宏,等. 三維適形調強放療對骨細粒棘球蚴生發細胞生長及凋亡影響的實驗研究[J]. 新疆醫科大學學報,2014, 7:821-823.

[10]Lu JH, Cheng WX, Yu XB, et al. The cell line establishment and immunogenic study ofEchinococcusgranulosus[J]. Acad J Sun Yat-Sen Univ Med Sci, 2001, 22(2): 81-84. DOI: 10.3321/j.issn:1672-3554.2001.02.001 (in Chinese) 陸家海，程維興，余興炳,等. 細粒棘球蚴細胞系培育及其免疫研究[J]. 中山醫科大學學報，2001，22(2)；81-84.

[11]Bao GS, HU HH, Jing T, et al.Invitroobservation on albendazole sulfoxide and its enantiomers againstEchinococcusgranulosusprotoscolex[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2008, 26(6): 459-465. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7423.2008.06.012 (in Chinese) 包根書, 張虹,景濤,等. 阿苯達唑亞砜及其對映體體外抗細粒棘球絳蟲原頭蚴作用. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2008，26(6)：459-461,465.

[12]Kang JF, Hu HH, Baishan BK, et al.Invitroobservation on the apoptosis induced by H2O2in protoscolex ofEchinococcusgranulosus[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2008, 26(5): 332-337. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7423.2008.05.003 (in Chinese) 康金風，胡漢華，白山別克，等. 過氧化氫體外誘導細粒棘球蚴原頭節細胞凋亡的實驗觀察[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2008，26(5)：332-337.

[13]Wu XJ, Cui L, Liu JJ,et al. Clinical observation of the therapr of TACE, PVE sequenced HIFU for primaryliver carcinoma[J]. J Mod Oncol, 2010, 18(09): 1780-1783. DOI: 10.3969/j.issn.1672-4992.2010.09.40 (in Chinese) 吳興軍，崔林，劉建軍，等. TACE、PVE聯合HIFU治療原發性肝癌的臨床觀察[J]. 現代腫瘤醫學,2010，18(09):1780-1783.

[14]Xia ZY, Xiong ZA, Zhang XX, et al. The study on the correlation between the volume of tissue necrosis and two dimensional ultrasound grey scale on rabbit muscle with high intensity focused ultrasound[J]. J Ultrasound Clin Med, 2006, 8(4): 200-203. DOI: 10.3969/j.issn.1008-6978.2006.04.003 (in Chinese) 夏正勇，熊正愛，張瀟瀟,等. 高強度聚焦超聲輻照兔肌肉組織后B超灰度值與壞死體積的相關性研究[J].中國超聲醫學雜志，2006,8(4):200-203.

[15]Wang WJ, Wu F, Wang ZL, et al. High intensity focused ultrasound for W256 liver cancer and activities of lymphocytes from peripheral blood in rats[J]. Chin J Exper Surg, 2001, 18(2): 33. DOI: 10.3760/j.issn:1001-9030.2001.02.033 (in Chinese) 王文見，伍烽,王芷龍,等. 高強度聚焦超聲對大鼠肝癌及外周血淋巴細胞功能的影響[J]. 中華實驗外科雜志,2001, 18(2): 33.

[16]Cao YD, Chen WZ, Wu F, et al. The effects of HIFU treatment on biological behaviors of breast cancer[J]. Chin J Ulrasound Med, 2002, 18(4): 285-288. DOI: 10.3969/j.issn.1002-0101.2002.04.016 (in Chinese) 曹友得, 陳文直,伍烽,等.高強度聚焦超聲治療對乳腺癌細胞生物學行為的影響[J].中國超聲醫學雜, 2002,18(4):285-288.

[17]He SX, Xiong LL, Wang GM, et al. HIFU treatment for 869 patients with abdominal and pelvic solid tumors and hyperplasia[J]. Chin J Ulrasound Med, 2002, 18(3): 180-183. DOI: 10.3969/j.issn.1002-0101.2002.03.007 (in Chinese) 何申戍,熊六林,王國民.高強度聚焦超聲治療869例腹腔、盆腔實性癌瘤和組織增生癥臨床初步報告[J].中國超聲醫學雜志，2002，18(3)：180-183.

[18]Poissonnier L, Chapelon JY, Rouviere O, et al. Control of prostate cancer by transrectal HIFU in 227 patients[J]. Eur Urol, 2007, 51(2): 381-387.

[19]Ji M, Zhao H, Hua YQ. Investigation to physico-mechanism and problem on HIFU treatment on tumor[J]. Shanghai Med Imag, 2005, 13(4): 310-312. DOI: 10.3969/j.issn.1008-617X.2005.04.023 (in Chinese) 冀敏, 趙洪, 滑炎卿. 聚焦超聲波治療腫瘤的物理機制及有關問題探討[J].上海醫學影像, 2005, (4):310-312.

[20]Wang JA, Zou XY, Ye B, et al. High intensity focus ultrasound kills hydatid cysts ofEchinococcusgranulosus[J]. Acta Academiae Medicinae Millitaris Tertiae, 2009,31(14): 1333-1336. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7423.2007.06.006 (in Chinese) 王俊安, 鄒曉毅, 葉彬,等. 高強度聚焦超聲波對棘球蚴的殺傷效果[J]. 第三軍醫大學學報,2009,31(14):1333-1336.

[21]Zhou TC, Zhang Y, Tong K,et al. Study on the reference method of catalytic concentration of lactate dehydrogenase at 37 ℃ and its clinical preliminary application[J]. J Mod Lab Med, 2013, 28(1): 24-26, 30. DOI: 10.3969/j.issn.1671-7414.2013.01.008 (in Chinese) 周鐵成, 張瑩, 童開,等. 探討乳酸脫氫酶37℃參考方法在臨床中的初步應用[J]. 現代檢驗醫學雜志, 2013, 28 (1):24-26,30.

[22]Chen GD, McWilliams ML, Fechter LD. Succinate dehydrogenase (SDH) activity in hair cells: a correlate for permanent threshold elevations[J]. Hear Res, 2000, 145: 91-100.

[23]Gimenez-Pardo C, Ros Moreno RM, De Armas-Serra C, et al. Presence of cholinesterases inEchinococcusgranulosusprotoscolices[J]. Parasitology, 2000, 7(1): 47-50.

[24]Zou XY, Ye B, Wang JA, et al. Effect of high intensity focused ultrasound on the enzymatic activity ofEchinococcusgranulosusprotoscolices[J]. Chin J Zoonoses, 2007, 23(11): 1097-1100. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2007.11.008 (in Chinese) 鄒曉毅，葉彬，王俊安，等. 高強度聚焦超聲波對細粒棘球絳蟲原頭節酶活性的影響[J]. 中國人獸共患病學報，2007，23(11)：1097-1100.

Effect of cell activity of protoscolices by super absorbent resin in coordination with high intensity focused ultrasound

ZHANG Jing1,2,WANG Meng-ying2,YE Bin1,2,ZHAO Yi-feng3,HAN Xiu-ming4,LI Fa-qi5,WANG Qi5

(1.DepartmentofPathogenicBiology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.ResearchCenterforMolecularMedicineandTumor,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Qinghai810001,China;4.QinghaiInstituteforEndemicDiseasePreventionandControl,Qinghai811602,China;5.StateKeyLaboratoryofUltrasoundEngineeringinMedicineCo-foundedbyChongqingandtheMinistryofScienceandTechnology,Chongqing400016,China)

We investigated the effects of a combination of high intensity focused ultrasound (HIFU) and super absorbent resin on the cell activities ofEchinococcusgranulosusprotoscolices with enzyme histochemical techniqueinvitro. The suspension with 2 000 protoscoleces/ML from the hydatid cysts in sample sheep liver was divided into groups: group I (blank control) was without HIFU treatment and SAR in the suspension, group II was only SAR, group III was treated with HIFU only, group IV was treated with HIFU and 0.01 g SAR, and groupⅤ was treated with HIFU and 0.1g SAR. Then, all these groups were exposed to the suspension of HIFU at a dose of 100 W acoustic powers for 30 seconds. The HIFU treated protoscolices were smeared onto glass slides for enzymatic activities localization. The protoscolex morphological changes and related enzyme activities in the HIFU treated protoscolices were determinated by the histochemical staining methods. Results showed the morphological changes of protoscoleces, the effect relationship was with dose of SAR, SAR was larger and the extent of damage was higher. There were clear and intact form in the nomal group, however, the protoscoleces showed stained and disintegrated in the tested groups. The death rate in the duratioh of single HIFU group was 80.1%, they were 87.82% and 89.1% respectively in the HIFU combined SAR groups. In the groups of the combination of HIFU and SAR, the main enzyme color of protoscoleces in shallow or disappeared, which suggested the treatment had an influence on enzyme activities of protoscolices. In conclusion, SAR could increase HIFU irradiation on the acute cytotoxicity and has certain delayed effect on protoscoleces, and the effect of HIFU on G-6-P and SDH inE.granulosusprotoscolices was significantly low.

protoscoleces; super absorbent resin; high intensity focused ultrasound; adenosine triphos-phate; glucose-6-phosphatase; succinate dehydrogenase

Ye Bin, Email: yebina@sohu.com

國家自然科學基金(No.30972567)和重慶市科學技術委員會(cstc2012jjA0032)資助

葉彬，Email：yebina@sohu.com

1.重慶醫科大學病原生物學教研室，重慶 400016； 2.重慶醫科大學分子與腫瘤研究中心，重慶 400016； 3.青海大學醫學院附屬第一醫院，西寧 810001； 4.青海省地方病預防控制所, 西寧 811602 5.省部共建超聲醫學工程國家重點實驗室，重慶 400016

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.001

R383

A

1002-2694(2015)11-0987-07

2014-12-11；

2015-04-26

Supported by the National Natural Scientific Foundation of China (No. 30972567) and the Project from Chongqing Science and Technology Commission (No. cstc2012jjA0032)