PrP105-132作用下體外小膠質細胞分泌IL-8及可能產生途徑

楊蘊天,福 泉

PrP105-132作用下體外小膠質細胞分泌IL-8及可能產生途徑

楊蘊天,福 泉

目的 探討PrP105-132作用下體外小膠質細胞分泌IL-8及可能產生途徑。方法 體外培養大鼠神經膠質細胞，用PrP105-132干預小膠質細胞，并阻斷NF-κB途徑，ELISA法檢測細胞上清液中IL-8含量，RT-PCR法檢測細胞NF-κB mRNA水平。結果 朊蛋白肽段干預后小膠質細胞活化，胞體增大，細胞突起變短、消失，呈圓狀、桿狀、阿米巴狀。同時細胞上清液中IL-8分泌量增多(P<0.01)，阻斷NF-κB途徑后IL-8分泌量顯著降低(P<0.01)。結論 PrP能夠誘導體外小膠質細胞分泌IL-8，IL-8產生主要依賴于NF-κB途徑。

朊蛋白；小膠質細胞；白細胞介素8；NF-κB

Supported by the Inner Mongolia Science Foundation (Grant No. 2013MS1130)

朊蛋白病又稱傳染性海綿狀腦病(TSEs)，是一類人畜共患的致死性神經退行性疾病，包括人類的克雅氏病(CJD)、格斯特曼氏綜合征(GSS)、致死性家族性失眠癥(FFI)、牛的海綿狀腦病(BSE)、羊的瘙癢病(scrapie)等[1]。其主要病理特征為腦組織中存在淀粉樣改變，其主要成分為異常PrP沉積，周圍可見大量的膠質細胞[2]。膠質細胞在神經元的生存和整個生命活動中起著支持、營養、保護和修復等重要作用，并具有不同的免疫活性，構成中樞神經系統(CNS)抵御病原體入侵的第一防線。細胞因子是固有免疫反應和適應性免疫反應的關鍵調節劑。在CNS感染性疾病中，組織浸潤性免疫細胞、CNS相關的巨噬細胞、小膠質細胞和星形膠質細胞已經被確定為CNS特異性炎癥中細胞因子的來源[3]。我們通過研究克雅氏病患者腦脊液，發現前炎癥細胞因子IL-8在腦脊液中含量升高[4]。因此，我們應用PrP干預體外小膠質細胞，同時阻斷NF-κB途徑，探討朊蛋白病中IL-8的可能來源及產生途徑。

1 材料與方法

1.1 朊蛋白肽段處理 PrP105-132肽段(KTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSA)采用固相合成法合成，實驗前將本條多肽取少量放入離心管中，先用適量的稀乙酸進行溶解，然后在加入雙蒸水對其進行稀釋，并用稀乙酸將其調回中性pH值。

1.2 細胞培養

1.2.1 神經膠質細胞混合培養 取10只新生Wistar大鼠(出生1 d)，在無菌條件下，剪開顱骨，取出腦組織(皮質和髓質)至盛有加糖D-Hanks液的培養皿中反復沖洗以去除血污。剝離腦表面的腦膜和血管，用加糖D-Hanks液洗腦組織塊1～2次。剪刀剪碎腦組織塊至1～3 mm，加入體積比組織塊總量多30～50倍的胰酶，在37 ℃條件下用吸管反復吹打消化液變混濁。加入完全培養液(高糖的DMEM/F12 1∶1培養液+10%胎牛血清)終止消化，再次吹打制成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至消毒離心管中，配平。離心1 000 r/min，10 min，棄上清。加定量完全培養液再次制成細胞懸液，接種入6個50 mL細胞培養瓶，密度為100 000～120 000個細胞/cm2。置于培養箱中，37℃條件下培養。

1.2.2 小膠質細胞的分離、純化、傳代 第3 d更換一次培養液，不換液培養10～12 d后再更換培養液，24 h后用D-Hanks液3∶1稀釋胰酶-EDTA溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA，1∶1)，37 ℃下作用40 min，輕輕晃動培養瓶，使貼附在底層星型膠質細胞上的小膠質細胞脫落下來，將含漂浮小膠質細胞的培養液轉入培養瓶中，24 h后更換培養液。待細胞長滿后，再次用胰酶消化進行傳代培養，得到小膠質細胞。

1.2.3 培養細胞的免疫細胞化學染色 待小膠質細胞長成片后，取出蓋片，依次進行0.9%鹽水清洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛固定40 min；0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH7.3)清洗3次，每次5 min，放入4 ℃冰箱備用。進行SP法免疫細胞化學染色進行鑒定。

1.3 實驗分組 體外培養小膠質細胞分為：正常對照組，PrP干預組，PrP+MG132組，每組6個孔樣，每孔1×106個細胞，共18個孔樣。以往的研究中我們已經明確最佳PrP干預時間點(48 h)及劑量(80 μmol/L)[5]。對照組：常規培養體外小膠質細胞；PrP干預組：每孔加入PrP105-132 80 μmol/L繼續培養；PrP+MG132組：每孔加入PrP105-132 80 μmol/L，MG132 3 μmol/L培養細胞。

1.4 標本采集 每組培養細胞48 h后，收集細胞上清液-20 ℃保存，用于IL-8的檢測。收集細胞-20 ℃保存，用于NF-κB mRNA檢測。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 IL-8含量的檢測 采用ABC夾心ELISA法。

1.5.2 NF-κB mRNA檢測 采用RT-PCR法。根據GenBank上NF-κB登陸號AY307375，β-actin登陸號BC063166設計引物。引物：βactin primer 1:5′-GTCAGG TCATCACTATCGGCAAT-3′， primer2:5′ -AGAGGTCTTTACGGATGTCAAC

GT -3′，147 bp；NF-κBprimer1:5′- ATGCGT TTC

CGTTACAAGTGCGAGG -3′， primer2:5′- GACCGCATTCAAGTCATAG TCCCCG -3′ ，378 bp。應用RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，取得產物加入PCR反應體系，擴增目的基因。后將擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，電泳結束后，凝膠內DNA于紫外燈下觀察并拍照。應用凝膠成像系統的分析軟件對電泳條帶進行密度分析，將樣品的密度與βactin的密度相比，即得該樣品mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1 培養小膠質細胞的活體觀察 第一代小膠質細胞少，呈漂浮狀，圓形，折光性強。傳代培養5 ～10 d后，細胞貼壁，數量增多，并長成片，細胞出現較多短小彎曲的突起。加入PrP105-132肽段后小膠質細胞胞體增大變圓，細胞突起變短、消失，呈圓狀、桿狀、阿米巴狀。再加入MG132后細胞形態改變不明顯。

2.2 培養小膠質細胞純度的鑒定 CD68單克隆抗體的免疫細胞化學染色顯示，成片的細胞CD68免疫反應強陽性(即小膠質細胞)，細胞圓形，部分細胞有較短的突起。用蘇木素復染的蓋片，在鏡下隨機抽取5個視野，記數視野下的CD68陽性細胞和CD68陰性細胞(蘇木素顯示細胞核)，求出CD68陽性細胞的百分比，所抽查的5張蓋片，其小膠質細胞的陽性率均在95%以上，見圖1。

2.3 IL-8的含量 PrP組培養細胞上清液中IL-8的含量顯著高于對照組(P<0.01)，PrP+MG132組IL-8的含量顯著降低，與PrP組比較差異有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 各組體外小膠質細胞IL-8分泌量(pg/mL)Tab.1 Secretion of IL-8 from microglial cells in vitro (pg/mL)

注：與對照組比較P<0.01；與PrP+MG132組比較P<0.01

P<0.01 represents the comparison with control group;P<0.01 represents the comparison with PrP+MG132 group.

胞漿染色黃色或棕黃色為CD68陽性細胞圖1 小膠質細胞CD68免疫組化染色(DAB顯色×200倍)Fig.1 CD68 staining(×200)

2.4 NF-κB RT-PCR檢測結果 PrP組NF-κBmRNA表達量明顯高于對照組，加入阻斷劑MG132后NF-κBmRNA表達量明顯降低(見圖2、3、見表2)。

M：Marker；1：對照組；2：PrP組；3：PrP+MG132組；

M: Marker; 1: control group; 2: PrP group; 3: PrP+MG132 group.

圖2NF-κBmRNA表達

Fig.2 The mRNA expression of NF-κB

3 討 論

PrP105-132肽段(KTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSA)對應PrPC的跨膜區域，是PrPC向PrPSc構型轉變的關鍵部位[6]，它是所有異常PrP同工型的共有結構。在不同的環境(離子強度、pH值、溶質成分等)中表現不同的二級結構。

M：Marker；1：對照組；2：PrP組；3：PrP+MG132組；

M: Marker; 1: control group; 2: PrP group; 3: PrP+MG132 group.

圖3 β-actin mRNA表達

Fig 3 The mRNA expression of β-actin

表2 NF-κB mRNA的表達(n=3)Tab.2 The expression of NF-κB at mRNA level (n=3)

注：與對照組比較＊P<0.01；與PrP組比較★P<0.01

Note:＊P<0.01 represents the comparison with control group;★P<0.01 represents the comparison with PrP group.

PrP105-132在體外與整個PrPSc有某些相同的性質，可形成淀粉樣纖維，并具有蛋白酶K抵抗性。我們在實驗中發現，體外培養小膠質細胞中加入該肽段后細胞胞體增大變圓，細胞突起變短、消失，呈圓狀、桿狀、阿米巴狀。進一步明確了PrP105- 132肽段對小膠質細胞的激活作用。小膠質細胞激活是朊蛋白病的神經病理性損害特征，并且這種特征已被體內和體外實驗中均得到證實[7]。我們的實驗發現PrP干預體外小膠質細胞后，培養上清液內IL-8含量升高，證實了朊蛋白病中小膠質細胞是細胞因子IL-8來源之一。

研究證實在CJD患者腦組織膠質細胞中NF-κB表達增高，免疫組化發現在病變處腦組織的神經元及膠質細胞的細胞膜上存在20S蛋白酶體，提示蛋白酶體系統在朊蛋白病發病中起著一定的作用[8]。我們的實驗中發現體外用PrP干預小膠質細胞NF-κBmRNA同樣表達升高，同時上清液中IL-8的含量增加。應用NF-κB特異性抑制劑MG132后NF-κBmRNA表達降低，上清液中IL-8的含量明顯降低。充分肯定了小膠質細胞NF-κB的活化與IL-8的產生有關，但PrP引起小膠質細胞NF-κB活化的機制尚不明確，可能的機制是：①PrP直接作用于小膠質細胞，導致蛋白激酶和蛋白磷酸化酶受到活化，經蛋白酶體加工降解NF-κB抑制蛋白IκB，釋放出有活性的NF-κB。②PrP可使小膠質細胞活化，活化的小膠質細胞釋放IL-1、TNF-α等[9-10]，這些前炎癥因子進一步促使NF-κB抑制蛋白IκB降解，NF-κB被激活。③ NF-κB活化后表達的細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等，反過來又促進NF-κB的活性，細胞因子和NF-κB相互促進，形成惡性循環。綜上所述，我們認為PrP作用后小膠質細胞分泌產生細胞因子IL-8，并且IL-8產生主要依賴于NF-κB途徑。

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Effect of PrP105-132 on secretion of IL-8 from microglial cellsinvitro

YANG Yun-tian,FU Quan

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China)

To investigate the effect of PrP105-132 on secretion of interleukin 8 (IL-8) from microglial cellsinvitroand its possible pathway, rat neuroglial cells were culturedinvitro, and these microglial cells were treated with PrP105-132. IL-8 level in supernatant fluid was detected using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) was evaluated using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot. The microglial cells were activated by treatment with PrP peptides. Cell bodies were augmented and presented round, rod, and amoeba-like shapes. The protuberances were shortened and finally disappeared. IL-8 level increased in supernatant fluid. However, the mRNA and protein expression ofNF-κBdecreased after these cells were treated with MG132, a specific inhibitor of NF-κB. PrP-treated microglial cells secreted IL-8. The secretion of IL-8 is mainly dependent on the NF-κB pathway.

prion; microglia; interleukin-8; NF-κB

內蒙古自治區自然科學基金項目(2013MS1130)資助

1.內蒙古醫科大學附屬醫院神經內科，呼和浩特 010050； 2.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，呼和浩特 010050； Email:yangyuntian@sina.com

R372

A

1002-2694(2015)11-1046-04

2014-11-22；

2015-05-21