應用變性高效液相色譜法檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性

吳文冰,蔡鵬威,方超英,沈 菁，陳 雯

應用變性高效液相色譜法檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性

吳文冰1,蔡鵬威2,方超英3,沈 菁1，陳 雯1

目的 建立DHPLC快速檢測Hp對克拉霉素耐藥性的新方法。方法 抽提56份經紙片瓊脂擴散法鑒定為克拉霉素耐藥的Hp菌株DNA及其對應的胃粘膜組織標本DNA，通過PCR技術擴增23S rRNA區187 bp基因，運用DHPLC技術對PCR產物進行突變分析，并進行DNA測序。結果 56份克拉霉素耐藥的Hp菌株DNA經DHPLC分析，有51份存在異源雙鏈峰，測序證實均存在點突變，5份無異源雙鏈峰，測序證實無點突變，故DHPLC對基因突變耐藥菌株的敏感性和特異性為100%，而且56份組織標本DNA檢測結果與菌株DNA檢測結果一致。結論 DHPLC可應用于Hp對克拉霉素耐藥性的快速檢測，具有廣闊的臨床應用前景。

幽門螺桿菌；23S rRNA；克拉霉素耐藥；變性高效液相色譜法;基因突變

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp是一種在人類胃粘膜中發現的革蘭氏陰性微需氧菌，它與各種消化性疾病，例如消化性潰瘍、胃炎及淋巴相關淋巴組織淋巴瘤等關系密切，是胃癌的高危因素之一。克拉霉素是根治Hp感染最重要的抗生素之一，近年來其耐藥性呈上升趨勢，而Hp對克拉霉素耐藥是導致治療失敗的主要原因。變性高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失,已被證實為一種快速、簡便的檢測基因突變的技術，目前廣泛應用于腫瘤和遺傳病等的基因研究。本研究應用DHPLC來檢測Hp的23S rRNA V區DNA序列突變，探討23S rRNA V區基因與耐克拉霉素的的相關性及其耐藥的分子機制，同時為臨床提供更為簡便、經濟、快速的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集本院胃鏡室尿素酶快速檢測法(福建三強公司)陽性的胃竇部或胃體部粘膜活檢標本160份，其中確診為消化性潰瘍62份，胃炎98份，男性104份，女性56份，年齡20～72歲，平均年齡(37.1±13.9)歲，所有研究對象均簽署知情同意書。所有活檢標本經充分研磨混勻后分成兩份，一份用于抽提組織DNA，另一份用于培養及藥敏鑒定。

1.2 研究方法

1.1.1Hp的培養及藥敏鑒定 培養采用含Hp選擇添加劑(OXOID公司)的哥倫比亞瓊脂(OXOID公司)培養基，微需氧環境(5%的O2，10%的CO2及850%的N2)培養5 d，所得單個菌落經顯微鏡鏡檢形態吻合，且尿素酶、過氧化氫酶及氧化酶均陽性的判定為Hp。藥敏鑒定參照文獻[1]采用紙片瓊脂擴散法，即取純培養72 h的菌落，用生理鹽水調成1.0×108CFU/mL，接種于含5%羊血的水解酪蛋白(Mueller-Hinton，M-H)培養基平板，在培養基平板中央貼15 μg的克拉霉素藥敏紙片(OXOID公司)，微需氧環境(5%的O2，10%的CO2及85%的N2)培養5 d，采用臨床和實驗室標準協會(2012)標準，用游標卡尺讀取抑菌環直徑，當抑菌環直徑大于17 mm時為克拉霉素敏感菌株，當抑菌環直徑小于13 mm時為克拉霉素耐藥菌株。

1.1.2Hp的DNA抽提及PCR擴增 隨機抽取50份克拉霉敏感菌株和所有克拉霉素耐藥菌株，采用QIAamp DNA Mini Kit和DNeasy Tissue kit(Qiagen公司)分別抽檢菌株及其對應的胃粘膜組織DNA，嚴格按操作說明書進行，所得產物作為模板，根據GenBank中Hp的23S rRNA V 區DNA序列(編號U27270)設計合成PCR擴增引物，上游引物為：5′- CGTAACGAGATGGGAGCTGT -3′，下游引物為：5′- ACTCCATAAGAGCCAAAGCCC -3′(上海鉑尚公司合成)，PCR條件：95 ℃變性30 s，95 ℃30 s、57 ℃30 s及72 ℃30 s，共35個循環，72 ℃延伸2 min，取5 μL產物進行瓊脂糖電泳，紫外燈下觀察結果，其余產物保存于-20 ℃冰箱。

1.1.3 DHPLC分析 以幽門螺桿菌標準菌株(編號：NCTC11637，本實驗室保存)為DHPLC分析的標準參考模板，將敏感菌和耐藥菌的菌株及組織DNA的PCR產物分別和標準菌株DNA的PCR產物等量混和，采用WAVETM2100型分析儀(Transgenomic公司，美國)進行檢測，在儀器分析軟件推薦的變性溫度上下1～2 ℃范圍內篩選出最佳變性溫度，所得數據采用隨機分析軟件WAVEMaker?進行分析。

1.1.4 DNA測序 將50份敏感菌和耐藥菌的菌株DNA及其對應的胃粘膜組織DNA送上海鉑尚公司進行測序。

2 結 果

2.1 克拉霉素耐藥率 從160份活檢樣本中鑒定出56份耐克拉霉素的Hp，耐藥率為35%。

2.2 PCR擴增產物電泳結果 50份敏感菌和56份耐藥菌的菌株和胃粘膜組織抽提所得的DNA均擴增出特異性條帶，擴增片段大小為187 bp，與設計的片段大小相一致，見圖1-2。

1: NCTC11637 wild-type; 2:Helicobacterpyloriresistant isolates; 3:Helicobacterpylorisensitivity isolates; M: DL500 DNA Marker (Takara).

圖1 幽門螺桿菌DNA擴增產物電泳圖

Fig.1 PCR product of clinicalHelicobacterpyloriisolates

2.3 DHPLC分析結果 56份耐藥菌的菌株DNA

1-16:Helicobacterpyloriresistant isolates; M: DL500 DNA Marker (Takara).

圖2 部分耐藥菌菌株DNA擴增產物電泳圖

Fig.2 PCR product of someHelicobacterpyloriresistant isolates

和胃粘膜組織DNA的PCR產物經DHPLC分析，結果完全一致。其中51份存在異源雙鏈峰，異常峰一致的樣本為同一基因突變型；5份無異源雙鏈峰，峰型與野生型一致。50份敏感菌菌株DNA和胃粘膜組織DNA的PCR產物經DHPLC分析，結果也完全一致，均無異源雙鏈，峰型與野生型一致。DHPLC分析結果見,圖3。

A: NCTC11637 wild-type; b: the point mutations of A2142G; c: the point mutations of A2143G.

圖3 DHPLC分析結果

Fig.3 Analysis of the DHPLC

2.4 50份敏感菌的菌株DNA和胃粘膜組織DNA的PCR產物經DNA測序，結果完全一致，與NCTC11637野生株DNA完全一致。 56份耐藥菌的菌株DNA和胃粘膜組織DNA的PCR產物經DNA測序，結果也完全一致，其中51份存在異源雙鏈峰，有31份為A2142G，20份為A2143G，測序結果見圖4。

3 討 論

克拉霉素的化學名稱是6-甲基紅霉素, 是當前應用最廣泛的大環內酯類抗生素之一。其抗菌機制是其能進入細胞內并結合在Hp23S rRNA功能區V區的50S大亞基上，抑制肽酰基轉移酶，影響核糖體的位移過程，阻止肽鏈的延長，從而抑制細菌蛋白合成，達到清除Hp的目的[2]，此外克拉霉素具有對酸穩定和在胃黏膜中濃度高、口服后生物利用率高和不良反應少等優點，加之臨床上含克拉霉素的三聯療法與不含克拉霉素的三聯療法相比，Hp根除率可以提高10%～20%，因此克拉霉素很快成為了根除Hp治療方案的主要抗菌藥物。

A: NCTC11637 wild-type; b: the point mutations of A2142G; c: the point mutations of A2143G.

圖4 DNA測序圖

Fig.4 Sequencing of the DNA

隨著克拉霉素的廣泛使用，臨床上逐漸開始出現耐克拉霉素的Hp，早期的耐藥率基本低于10%，而近年來其耐藥率呈明顯的上升趨勢，超過了20%(如亞洲為21%，美國為29.3%)[3]，更為嚴重的是在兒童中也出現了高耐藥的Hp[4]，因此闡明克拉霉素的耐藥機制迫在眉睫，目前有關克拉霉素耐藥機制的研究越來越多，使人們對克拉霉素的耐藥有了比較全面深入的研究，最主要的機制可能克拉霉素結合靶位突變有關，包括：23S rRNA V區的肽基轉移酶基因編碼區域出現點突變和23S rRNA轉錄后甲基化區域的突變[5-6]，前者是目前比較公認的重要耐藥機制之一，包括A2143G、A2142G、A2142C、A2115G、G2141A、C2147G、T2190C、C2195T、A2223G和C2694A[7]，這些突變表明任何V區基因突變都可能導致Hp對克拉霉素的耐藥，其中以A2143G和A2142G最常見，但不同地區，不同種族，不同人群的主要突變類型可不相同，如Vega等研究認為兒童以A2143G基因突變為主，成人以A2142G基因突變為主[8]。其次還與多重耐藥流出泵(multidrug resistance efflux pump)基因改變[9-11]，大環內酯類藥物之間的交叉耐藥[12-13]，以及rRNA甲基化酶引起大環內酯類藥物失活、細胞膜滲透性下降、大環內酯類藥物排出增加等[14]有關。

目前檢測Hp耐藥的方法可以分為兩類：一類是表型檢測，另一類是基因型檢測。表型檢測主要是培養加藥敏鑒定(包括瓊脂糖稀釋法和Etest法)，但Hp培養條件較為苛刻，且培養周期較長，一般要1～2周才能出報告，而且由于活檢標本污染等原因導致其有10%的漏檢率，從而限制了其臨床應用。隨著對Hp耐藥研究的深入，越來越多的研究表明Hp23S rRNA的V區基因點突變是導致Hp耐藥的主要原因，于是基于PCR的分子生物學方法被引入了Hp耐藥的檢測，1996年Versalovic等[15]首次通過PCR-限制性片段長度多態性證實了Hp23S rRNA的V區的A2142G和A2143G與Hp耐藥有關，此后人們相繼應用PCR-寡核苷酸連接分析法、PCR-DNA酶聯免疫測定法DNA、PCR逆轉錄雜交線探針分析法、 PCR選擇性同源雜交分析法等檢測Hp的基因點突變，這些方法的操作都相對復雜，而且耗時，難以在臨床推廣。

新近，一種新的高通量篩選DNA序列變異的技術-變性高效液相色譜法開始逐步應用于臨床，該技術可在短時間內(10 min左右)自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失,其原理是用離子對反向高效液相色譜法分離并檢測異源雙鏈。該方法具有自動化、高通量、快速、檢出率高(可達95%以上)、檢出DNA片段大小范圍廣等優點，主要用于人類基因多態性和疾病相關性的研究。Patrizia Posteraro等首先嘗試將DHPLC應用到Hp23S rRNA的V區基因點突變的檢測，其研究表明DHPLC能檢測到所有81份耐藥菌株和96份胃粘膜組織DNA中點突變，并且每種點突變都伴有特異的洗脫峰型[16]。我們實驗結果表明，在56份耐克拉霉素的Hp耐藥菌株DNA中檢出51份存在峰型異常，經基因測序證實都存在點突變，其中31份為A2142G，20份為A2143G，5份未檢測出峰型異常，基因測序也未見突變，50份敏感菌菌株DNA經DHPLC分析均無異源雙鏈峰，基因測序也未見突變，與NCTC11637野生株一致，表明DHPLC對基因突變耐藥菌株的敏感性和特異性均達到100%，同時，我們也將這50份敏感菌菌株和56份耐藥菌株對應的組織DNA進行DHPLC分析，得到了相同的的實驗結果，提示DHPLC不但可以用于菌株DNA，也可以用于組織DNA的檢測，這與Patrizia Posteraro等研究相似，這就為臨床提供了一個更為快速的檢測方法，從而避免了耗時的培養過程，更為臨床盡早采取正確的治療方案提供依據。

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Detection of clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriby denaturing high performance liquid chromatography assay

WU Wen-bing1,CAI Peng-wei2,FANG Chao-ying3,SHEN Jing1,CHEN Wen1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,FujianProvincialSouthHospital,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;3.DepartmentofEndoscopeCenter,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

The aim of this study is to evaluate the denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) assay for the rapid detection of clarithromycin resistance inHelicobacterpylori. A 187 bp fragment of the 23S rRNA gene was amplified using DNA from 56 clinicalHelicobacterpyloriisolates, which were shown to be resistant to clarithromycin by agar dilution, and directly from the homologous gastric biopsies. DHPLC and sequencing were used to detect mutations in all PCR products. For the 56 resistant isolates, 51 of the 56 resistant isolates showed heteroduplex peaks, which were easily distinguishable from the homoduplex pesks of the wild-typeHelicobacterpylorireference strain. Sequencing revealed point mutations in all the 51 resistant isolates. Five of the 56 resistant isolates showed homoduplex peaks, sequencing revealed no point mutations in all the 5 resistant isolates. Our results suggested that the DHPLC assay, whose sensitivity and specificity were 100% in detecting point mutations, was a valid tool for rapid assessment of clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriand that in the future it could be used directly on biopsy specimens, avoiding the need for culture-based methods.

Helicobacterpylori; 23S rRNA; clarithromycin resistance; denaturing high performance liquid chromatography assay; gene mutations

福建省衛生廳青年科研課題(No.2009-2-3)資助

蔡鵬威,Email:cpweico@163.com

1.福建醫科大學省立臨床醫學院 福建省立醫院檢驗科，福州 350001； 2.福建醫科大學省立臨床醫學院 福建省立金山醫院檢驗科，福州 35000； 3.福建醫科大學省立臨床醫學院 福建省立醫院內鏡中心，福州 350001

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.013

R378

A

1002-2694(2015)11-1050-04

2015-07-02；

2015-09-11