河南省20株布魯氏菌鑒定與PFGE分子分型研究

趙嘉詠,蘇 佳,張白帆,夏勝利,穆玉姣,呂家銳,黃學勇

河南省20株布魯氏菌鑒定與PFGE分子分型研究

趙嘉詠,蘇 佳,張白帆,夏勝利,穆玉姣,呂家銳,黃學勇

目的 檢測與分析河南省2010-2012年20株布氏菌型別及PFGE脈沖場凝膠電泳指紋圖譜特征。方法 采集病人靜脈血，分別以試管凝集試驗(SAT)、雙相血培養瓶分離培養、熱裂解法制備DNA模板和AMOS-PCR鑒定4種布氏菌型別。采用脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)對檢出的布魯氏菌進行分子分型鑒定。結果 分離培養的20株布魯氏菌經鑒定，19株為羊種，1株為牛種；羊種布魯氏菌經XbaI酶切與脈沖場凝膠電泳后，共獲得了8種不同帶型，帶型相似度在80%～100%之間，牛種與羊種菌株在帶型相似度上差異較大，具有較好的分辨能力。結論 河南省病人感染的布魯氏菌以羊種為主要型別，AMOS-PCR與PFGE作為布魯氏菌菌型鑒定與分子分型的技術手段，為布魯氏菌病的病原學監測與應急檢測提供依據。

布氏菌；AMOS多重PCR；PFGE

布魯氏菌病(brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌屬的細菌侵入機體，引起的人獸共患變態反應性疾病，是中華人民共和國傳染病防治法規定報告的乙類傳染病。近年來我國動物間和人間布病疫情有回升勢頭。本研究對2010-2012年內分離自河南省監測哨點醫院的20株布魯氏菌進行分子生物學檢測、分型，為深入了解和掌握布魯氏菌的病原構成、分子流行病學特征和相關疾病的監測、暴發預警、調查、溯源提供基線與參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 自2010-2012年河南省監測哨點醫院與河南省疾控中心發熱門診采集的布魯氏菌試管凝集法(SAT)陽性病人血液樣本。標準菌株16M 、544A、1330S 由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布病室贈送。

1.1.2 主要試劑 雙相血培養瓶購自法國bioMerieux公司；裂解綿羊血平板購自安圖生物公司；TaqDNA聚合酶購自美國Promega公司；引物(HPLC純化)由Invitrogen合成；Seakem Glod瓊脂糖購自美國LONZA公司；蛋白酶K購自英國Roche公司；限制性內切酶XbaI購自大連寶生物公司；Tris-Hcl/EDTA/5XTBE購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養 病人新鮮血液5～8 mL，無菌注射接種于雙相血培養瓶，混勻后置37 ℃ 恒溫培養箱中培養，每隔2 d觀察1次，有菌生長時挑出菌落轉種綿羊血瓊脂中培養。

1.2.2 形態學與生化鑒定 挑取可疑菌落進行革蘭氏染色、鏡檢與H2S試驗。G-為短小桿菌，H2S+為疑似布魯氏菌。

1.2.3 DNA模板制備 刮取布魯氏菌培養物，0.85%滅菌生理鹽水調節菌濃至1麥氏濁度，充分振蕩懸浮。2 ℃～8 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄去上清。沉淀加入100 μL滅菌去離子水，再次充分振蕩懸浮混勻。100 ℃煮沸15～20 min，12 000 r/min離心5 min，上清作為PCR擴增模板[1]。

1.2.4 AMOS-PCR檢測 反應體系為50 μL：其中PCR反應液(含有Taq酶、特異性引物、 dNTP及反應緩沖液)46 μL，模板DNA 4 μL。檢測引物針對布魯氏菌不同亞種設計，引物濃度IS711-specific primer 1 μmol/L，其余鑒定引物0.2 μmol/L。AMOS-PCR反應參數設置為：預變性95 ℃/5 min，1個循環；95 ℃/1.5 min，56 ℃/2 min，72 ℃/2 min，30個循環；72℃/5min，1個循環；4 ℃保存。取8～10 μL PCR擴增產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(140 V,30 min)[2，4]。

1.2.5 PFGE分型 H9812標準菌株作為分子量標記。限制性內切酶XbaI(75U)，37 ℃酶切2 h。電泳參數：電壓6 V/cm，分子量50 kb～400 kb，脈沖時間2～25 s，線性轉換，電場角度120°，電泳時間19 h，電泳液1×TBE，電泳液溫度14 ℃。電泳結束后膠塊用GelRed染料染色20 min后純水清洗40 min后凝膠成像儀拍照(曝光時間3.0 s，去過飽和成像)。BioNumerics6.0軟件對電泳圖譜進行數據分析，繪制聚類分析樹狀圖。聚類算法為非加權配對平均法(UPGMA)，電泳條帶位置優化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%認定為同一PFGE帶型[5]。

2 結 果

2.1 疑似布魯氏菌感染病人血液經雙相血培養、形態學與生化鑒定，AMOS-PCR檢測最終確認布魯氏菌20株，其中羊種布魯氏菌19株，牛種布魯氏菌1株。特別值得注意的是我們從同一患者體內分離出牛種和羊種兩株布魯氏菌。(圖1)。

M：DNA marker 100 ladder；1：牛種布魯氏菌；2-16：羊種布魯氏菌

M：DNA marker 100 ladder；1：B.melitensis；2-16：B.bovis.

圖1 布魯氏菌AMOS-PCR電泳圖譜

Fig.1 AMOS-PCR products ofBrucellaspp.

2.2 PFGE分子分型結果 20株布魯氏菌經XbaI酶切后進行PFGE分型，20株菌分為羊種、牛種兩大族群共9種不同帶型(Dice, position tolence1.5%) ，各帶型包含菌株數為1～7株不等。其中5種帶型包含菌株數>2株，其余4種帶型只包含一株菌。羊種族群19株菌又被分為兩大帶型(相似度>85%);牛種族群1株菌被單獨劃歸為一種帶型，與羊種菌株存在顯著差異(相似度<40%)。(圖2)。

3 討 論

河南省在歷史上一直是以羊種布氏菌為主的農區型布魯氏菌病重點疫區，全省布病疫區縣多達76個。雖然上世紀80年代布病疫情得到了有效控制，但自2000年以后，河南省同我國其他傳統疫區一樣，布病疫情出現了快速回升和強勢反彈的勢頭，防控形勢嚴峻。長期以來，受制于歷史原因和現實客觀條件的限制，疾控部門對于布病的診斷與監測一直停留在以試管凝集試驗(SAT)為代表的免疫學檢測和以流行病學調查為主的層面上，缺乏對布魯氏菌病原學研究的本底資料。因此，開展布魯氏菌的分離、鑒定及分子分型，掌握其種屬構成、變異變遷和分子流行病學特征，為布魯氏菌病的監測、暴發預警、調查、溯源提供基線與參考數據就顯得尤為重要。從本研究的20株布魯氏菌鑒定結果來看，河南省布病病人感染仍然以羊種布魯氏菌為主，這和歷史研究文獻結論是相吻合的。同時我們也發現，在個體病人中也存在牛種布魯氏菌感染及牛種、羊種并行感染的情況，值得我們認真和深入研究。

圖2 羊種與牛種布魯氏菌PFGE電泳及聚類分析圖譜Fig.2 PFGE cluster analysis of B. melitensis and B. bovis

脈沖場凝膠電泳技術作為近年來細菌性傳染病分子流行病學研究的工具，越來越受到重視并得以推廣應用[3]。它和MLVA、MLST等分子分型技術一起在布魯氏菌病的監測、早期預測預警，暴發疫情與突發公共衛生事件調查處置等方面發揮著重要的作用[6-7]。本研究利用該技術分析了我省病人中20株羊種與牛種布魯氏菌PFGE“指紋圖譜”特征，從染色體DNA限制性位點多態性角度驗證了羊種與牛種兩種生物型別間的巨大差異，為布魯氏菌病原學研究積累了分子基線數據。從帶型分布看，19株羊種布魯氏菌最顯著的特點就是分為兩種帶型，帶型內呈現出相當高的相似度(大多數帶型間的相似度>95%)，從溯源和多態性角度看需做進一步分析和驗證，掌握布魯氏菌種與亞種在不同酶切和電泳條件下的帶型特征，如優勢帶型與暴發帶型間的差異等，同時結合病人臨床信息，綜合應用病原學和流行病學研究方法對聚類分析圖譜進行合理的解讀和判定。

[1]Bricker BJ, Halling SM. Differentiation ofBrucellaabortusbv. 1, 2 and 4,Brucellamelitensis,Brucellaovis, andBrucellasuisby PCR[J]. Clin Microbiol, 1994, 32: 2660-2666.

[2]Romero C, Gamazo C, Pardo M, et al. Specific detection ofBrucellaDNA by PCR[J]. Clin Microbiol, 1995, 33: 615-617.

[3]Cui BY, Yin JM, Li LY, et al. Typing of Brucella isolates by repetitive element sequence-based polymerase chain reaction[J]. Dis Surveill, 2005, 20(8): 397-400. (in Chinese) 崔步云, 尹繼明, 李蘭玉, 等. 布魯氏菌的Rep-PCR分型研究[J]. 疾病監測, 2005, 20(8): 397-400.

[4]Jiang H, Cui BY, Zhao HY, et al. Use of AMOS-PCR assay for the species identification ofBrucella[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(02): 107-109. (in Chinese) 姜海, 崔步云, 趙鴻雁, 等. AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的應用[J]. 中國人獸共患病學報, 2009, 25(02): 107-109.

[5]Cui BY. Typing ofBrucellaby pulsed field gel electrophoresis[D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2006，21-36. (in Chinese) 崔步云. 布魯菌脈沖場凝膠電泳分型研究[D]. 太原：山西醫科大學系, 2006，21-36.

[6]Lopez Goni I, Garcia Yoldi D, Marin CM, et al. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(10): 3484-3487.

[7]Baily GG, Kranhn JB, Drasar BS, et al. Detection ofBrucellamelitensisandBrucellaabortusby DNA amplification[J]. Trop Med Hyg, 1992, 95: 271-275.

Identification and PFGE molecular typing ofBrucellastrains in Henan Province, China

ZHAO Jia-yong,SU Jia,ZHANG Bai-fan,XIA Sheng-li,MU Yu-jiao,LU Jia-rui,HUANG Xue-yong

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

The aim was to detect and analyzeBrucellastrains isolated from patients in Henan Province from 2010 to 2012 with AMOS-PCR amplification and pulsed field gel electrophoresis technology, provide baseline for the monitoring, early warning, outbreak investigation, and tracing of brucellosis. We collected SAT tested positive patients blood and cultured with double phase blood bottle for at least 20 days. AMOS-PCR identification of 4 species ofBrucellatype was conducted using DNA template with thermal decomposition method after morphological and biochemical identification. The pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was made for getting the molecular type characters ofBrucellastains. Results showed that 20 strains ofBrucellawere identified by morphological, biochemical and AMOS-PCR technology, in which 19 strains were sheep species, 1 strain was cattle species.Brucellastrains were digested with XbaI and made pulsed field gel electrophoresis. The result indicated that the similarity coefficient among the 19 sheep species isolates was from 80% to 100% with 9 belt types, which had a great difference from cattle species. The sheep speciesBrucellais the main type in patients in Henan Province. AMOS-PCR and PFGE technology provide a strong tool for the brucellosis monitoring and emergency detection.

Brucella; AMOS- PCR; PFGE

Xia Sheng-li, Email: xiasl@hncdc.com.cn

“十二五”國家科技重大專項(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)聯合資助

夏勝利，Email：xiasl@hncdc.com.cn

河南省疾病預防控制中心，鄭州 450016

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.015

R378

A

1002-2694(2015)11-1058-03

2015-04-17；

2015-08-16

Supported by the National Science and Technology Major Project (Nos. 2012ZX10004201& 2012ZX10004203)