銅綠假單胞菌毒性蛋白ExoU的研究進展

鞠曉紅，李正花，馬愛新，李 瑤

銅綠假單胞菌毒性蛋白ExoU的研究進展

鞠曉紅1，李正花2，馬愛新1，李 瑤1

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，有多種毒力因子，其中Ⅲ型分泌系統(T3SS)在其引起的急性感染中發揮至關重要的作用，是銅綠假單胞菌感染、致病的重要因素。T3SS主要通過靶向輸送4種效應蛋白(ExoS、ExoT、ExoU和ExoY)對宿主細胞發揮毒性作用。其中ExoU是最具破壞性的蛋白，與感染的發生、預后及治療密切相關。本文主要將近年來與毒性蛋白ExoU有關的研究進展做一簡要綜述，旨在為銅綠假單胞菌感染的控制及治療提供參考。

銅綠假單胞菌；Ⅲ型分泌系統；ExoU；多重耐藥；毒力基因

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界及人和動物機體皮膚、呼吸道及腸道中，是一種常見的條件致病菌。在機械性氣道損傷、免疫抑制或患有艾滋病、腫瘤的患者常引起急性肺炎，尤其肺纖維化患者更易引起致死性感染[1]。目前已知銅綠假單胞菌成功感染宿主細胞并導致疾病的主要原因是Ⅲ型分泌系統(typeⅢsecretion system,TTSS)的作用，通過T3SS將毒性蛋白ExoS、ExoT、ExoU和ExoY直接注入宿主細胞，引起肌動蛋白細胞骨架重排、細胞壞死，有利于細菌的入侵和擴散并逃避宿主吞噬細胞的吞噬或降解[2,3]。4種蛋白中，ExoU是主要毒性蛋白，ExoU陽性菌株在體內外均可引起細胞壞死、死亡，直接關系到感染患者的病情進展及預后，在致病過程中發揮關鍵作用[4-5]。因此，深入探討毒性蛋白ExoU在感染中的作用及機制，成為研發新藥靶標、有效預防和治療銅綠假單胞菌感染的迫切需要。

1 ExoU蛋白的基因控制

ExoU蛋白的表達和分泌由銅綠假單胞菌T3SS的毒力基因對exoU/spcU決定。spcU基因編碼ExoU蛋白的分子伴侶SpcU(一種小分子酸性蛋白)，常與ExoU以1∶1的比例在菌細胞內特異性結合，阻止蛋白不恰當聚合或分泌、提高分泌前及分泌時的穩定性，但本身不向菌細胞外分泌。銅綠假單胞菌T3SS涉及的相關基因有43個，其中exoU/spcU位于染色體上與轉位、分泌和調節相關基因不同的基因島(genomic island)上。Kulasekara BR等[6]對來自美國不同醫院的6株銅綠假單胞菌利用酵母重組克隆技術進行exoU/spcU基因島檢測，結果共發現3個ExoU基因島(分別命名為A島、B島和C島)，均插入在tRNALys基因中，占據兩個開放讀碼框架(ORF)。A島長度為81.17 kb，包含77個ORF，GC平均含量57.0%，明顯低于核基因組的66.7%，exoU/spcU位于第76和77 兩個ORF；B島長度為29.85 kb，包含41個ORF，GC平均含量56.8%，exoU/spcU位于第26和27 兩個ORF；C島長度為3.89 kb，包含3個ORF，exoU/spcU位于第2和第3個ORF，與A島極其相似，起始部位的256 bp 85.2%與A島相同，3個基因島兩端的正向重復序列完全一致。進一步將A島的基因序列與質粒pKLC102上的exoU基因序列比較，發現二者高度同源。 pKLC102整合酶基因93%與A島相同，使其有能力插入到染色體tRNALys基因位點兩側，據此推斷銅綠假單胞菌的ExoU基因島可能來源于與pKLC102質粒親緣關系密切的帶有插入序列和轉座子的整合型質粒。推測最初銅綠假單胞菌可能通過基因水平轉移獲得攜帶有exoU/spcU基因的祖先質粒(ancestral plasmid)，隨后發生染色體整合，在整合過程中維持質粒獨立存在和轉移的部分必須基因被刪除或缺失，最終導致整合的外源基因以基因島的形式穩定存在于染色體基因組中，exoU/spcU基因轉移罕見。不同銅綠假單胞菌ExoU基因島中許多保守片段也有較大變化，但全部保留有完整的exoU/spcU基因對，由此認為選擇分泌功能性ExoU蛋白可能是細菌適應環境壓力的進化結果。

一般認為，在T3SS 4種毒素蛋白的結構基因exoS、exoT、exoU和exoY中，同一株銅綠假單胞菌不能同時攜帶exoS和exoU基因，二者互為排斥[7-8]。由于exoS基因缺乏基因島的典型特征，目前認為exoS與基因島無關，因此推測exoU與exoS基因相互排斥不可能是質粒不相容的結果，exoS基因可能在exoU/spcU基因整合進細菌染色體之前已經被菌體獲得，由于遺傳因素將隨后進入菌體的ExoU基因島刪除[6]。也有人認為可能是二者占據相同的基因位點因而互相排斥[9]。但最近幾年國內外的多項研究均顯示在同一株銅綠假單胞菌中可以同時檢測到exoS和exoU基因[10-12]，具體機制不明，是否意味著細菌在環境壓力下發生基因位點改變、抑或毒力增強的結果？今后仍需進一步加強研究工作。

2 ExoU蛋白結構

ExoU是由687個氨基酸殘基組成、分子量74 kD的水溶性蛋白質，以往研究認為ExoU由3個結構域(domain)組成，從N端到C端分別是分子伴侶結構域、磷脂酶A2(PLA2)結構域和膜定位結構域[13]。Claire G等[14]根據功能進一步將分子伴侶結構域劃分為兩個子域(subdomain)，是序列上不連續而空間構象相鄰的兩部分。Halavaty AS等[15]研究認為，ExoU實際折疊成4個結構域(圖1[15])，結構域內部存在多個無序區域(圖中Ⅰ～Ⅷ表示)，其中PLA2活性結構域無序基序最多，推測可能是細菌控制正確發揮PLA2活性的一種生理機制。ExoU分泌后在輔助活化因子作用下，無序基序轉變為功能性結構，發揮PLA2的細胞毒活性。空間構象上分子伴侶SpcU與其中的3個功能區相接觸。

結構域1是分子伴侶SpcU結合區(SpcU-BD)，由不連續的兩部分組成，靠近N端的55-101位氨基酸和C端的472-502位氨基酸區域，其中65-101位氨基酸殘基折疊成1個α螺旋和4個β片層結構，是與分子伴侶相結合的最主要部位；472-502位氨基酸殘基折疊成1個β片層和4個α螺旋結構，沒有結合SpcU的能力，推測可能作為一個獨特的“平臺”結構，其功能是執行兩個關鍵結構域(PLA2域和膜定位域)的橋聯。

結構域2是PLA2活性區(PLA2-D)，以往研究認為這一區域位于107-357位氨基酸之間，而Halavaty AS等[15]通過純化的ExoU晶體結構研究認為，這一區域可能實際開始于102位氨基酸，延伸至471位氨基酸，357位異亮氨基酸之后的基序可能有助于反平行β片層結構形成，以利于與膜定位區和SpcU結合。PLA2酶催化區與其他已知的磷脂酶具有很低的序列同源性，但核心β片層與人類胞漿型PLA2(c PLA2)和植物patain樣PLA2結構高度相似[16-17]。PLA2活性和細胞毒性高度依賴Ser142、氧陰離子洞(Oxyanion hole)及Gly286，三者空間構象相鄰。Ser142和Asp344構成ExoU蛋白的催化二分體(catalytic dyad)，任何一個位點被替換或變異都會使PLA2活性喪失。Ser142位于漏斗樣結構中心，周圍包繞許多柔韌的環狀結構，3個甘氨酸(Gly111,112,113)在相鄰位置構成氧陰離子洞作為支撐骨架，維持磷脂酶反應中間過渡狀態的電荷穩定；酶催化位點Asp344位于無序區Ⅲ。Lys178是ExoU進入宿主細胞后的泛素化位點。一旦ExoU在細胞膜上定位，Lys178即成為泛素化的目標。Lys178靠近酶活性中心，位于具有高度柔韌性的區域，側鏈距離Ser142約7埃。然而泛素化的結果不是導致ExoU蛋白降解，而是使ExoU蛋白活化的關鍵步驟，詳細機制尚未闡明，推測可能是泛素修飾后引起蛋白質結構重排的結果[18]。

503-603位氨基酸殘基和604-687位氨基酸殘基分別構成了ExoU的第3個和第4個結構域，主要發揮膜定位功能，使效應蛋白靶向進入宿主細胞膜的區域。結構域3形成左手螺旋，而結構域4形成的螺旋束同時與分子伴侶和PLA2區域相連。679-683位氨基酸變異菌株不能與細胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)結合，提示ExoU的細胞膜靶位點是PI(4,5)P2，而發揮膜定位的關鍵基序是679-683位氨基酸殘基[14]。不過，多數研究認為膜定位區位于550-687氨基酸之間，屬于1個獨立功能區[19-20]。至于ExoU的功能區到底如何劃分更為合理，有待于對ExoU作用機制的更深入研究。

圖1 銅綠假單胞菌ExoU蛋白結構圖Fig.1 Structure of ExoU of Pseudomonas aeruginosa

3 ExoU蛋白的生物學活性及調控

ExoU是具有強大細胞毒性的磷脂酶A家族成員，主要表現為PLA2活性，屬于鈣非依賴性磷脂酶，又稱含patatin磷脂酶結構域酯酶，是一種天然表面活性劑，未被T3SS分泌時，與分子伴侶SpcU以1:1比例結合成無活性復合物。分泌后選擇性與真核細胞膜上的PI(4,5)P2結合，在輔助因子的協同作用下ExoU蛋白被激活，刺激宿主細胞釋放大量花生四烯酸進而生成生物活性介質，誘導細胞變圓、皺縮，進而導致細胞骨架崩潰、裂解死亡，細胞死亡的主要原因是壞死[19,21-22]。在Hela細胞感染模型中，培養液中預先加入PI(4,5)P2可明顯增強ExoU的細胞毒性，進一步研究發現PI(4,5)P2不是通過增加細菌數量而是通過增強效應發揮細胞毒作用[14]。在鼠肺炎模型中，活化的ExoU能引起巨噬細胞和上皮細胞急性細胞毒反應；在人類嚴重的銅綠假單胞菌感染病例，ExoU能特異性殺傷中性粒細胞，降低患者免疫防御能力，使患者更易發生二重感染[23]。除了主要的細胞毒活性外，在上皮細胞ExoU還能激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉導通路和AP-1介導的促炎基因表達[24]，激活NK-κB信號通路，刺激IL-8基因表達及IL-8分泌[25]。

同ExoS、ExoT和ExoY相似，ExoU發揮細胞毒活性需要真核細胞提供輔助因子的協同刺激，這是細菌的一種重要自我保護機制，因為ExoU完全有能力水解細菌自身細胞膜，這種細胞輔助因子的真核細胞特異性使銅綠假單胞菌能選擇性的破壞宿主細胞而不影響細菌的自身安全及產毒。在體外，將純化的重組ExoU(rExoU)與脂質體共培養檢測不到PLA2活性，而與酵母細胞或哺乳動物細胞提取液共培養即可檢測到PLA2活性，經蛋白酶或加熱處理細胞提取液后PLA2活性顯著降低，提示在真核細胞中存在蛋白類輔助因子。目前認為真核細胞泛素、泛素化蛋白及Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)可能是這種毒素的重要活化因子[26,27]。進一步研究發現[26,28]，SOD1經處理消除酶活性(如去除金屬離子)后依然能夠活化ExoU，說明輔助因子SOD1可能不是通過酶活性，而是通過誘導ExoU發生結構重排使其發揮活性效應。Benson MA等[18]采用位點定向的自旋標記技術(SDSL)結合電子順磁共振光譜技術(EPR)研究rExoU功能時發現，在S137R1中加入SOD1和脂質體能發生明顯的光譜變化，并且存在SOD1濃度依賴性；在S643R1中單獨加入脂質體無光譜變化，但加入SOD1后發生顯著光譜改變，推測ExoU的構象改變可能發生在酶催化活性部位和C端區域。純化的ExoU/SpcU復合物，即使在輔助因子SOD1過剩時，仍然缺乏水解磷脂類似物(如花生四烯酰基硫脂酰膽堿)的能力，推測ExoU的輔助活化因子和分子伴侶SpcU可能以相似的方式與蛋白結合，因而二者相互競爭，SpcU的存在抑制PLA2活性發揮[15]。PI(4,5)P2與泛素共存時，能發揮協同作用增強ExoU的PLA2活性；PI(4,5)P2含量減少的酵母細胞突變體，對ExoU介導的殺細胞效應敏感性下降，由此推測PI(4,5)P2可能是一種新型的ExoU共激活因子[21]。

4 ExoU蛋白相關性實驗室檢測

目前圍繞銅綠假單胞菌ExoU蛋白的檢測主要包括三方面內容，一是直接檢測蛋白，二是檢測蛋白編碼基因exoU，三是檢測蛋白的PLA2生物學活性。由于T3SS分泌效應蛋白的先決條件是有適宜的環境條件，并與宿主細胞密切接觸，由宿主細胞提供輔助活化因子，因此蛋白直接檢測和PLA2活性檢測不適用于臨床分離菌株常規檢查，一般只用于實驗室研究。目前臨床應用較多的是基因檢測，通過設計引物擴增基因、測序，檢測臨床分離菌株exoU基因攜帶率，間接反映ExoU蛋白與臨床疾病類型、病情進展、預后及耐藥等相關性。

5 ExoU與臨床疾病

由于存在地區、環境、用藥習慣及疾病類型等差異，相關文獻報道ExoU蛋白編碼基因exoU檢出率相差很大，比較趨向一致的結果是exoU陽性菌株感染病例一般較為嚴重。36株燒傷患者傷口分泌物檢出的多藥耐藥銅綠假單胞菌中，exoU基因100%陽性[29]。糖尿病足患者感染exoU陽性菌株與exoS陽性菌株相比具有更低的治愈率(25% vs 65.2%)和更高的截肢率(33.3% vs 8.7%)[30]。Idris SN等研究認為[31]exoU陽性菌株存在感染部位和性別差異，更易引起呼吸道感染(61%)，在男性患者中檢出率更高(83%)。Garey KW等[32]回顧性分析122例銅綠假單胞菌感染的菌血癥患者，發現exoS陽性檢出率明顯高于exoU(72.1% vs 27%)，但二者致死率未見顯著差異(35% vs 43%)，推測菌血癥患者死亡率高的原因可能與銅綠假單胞誘導血管內皮細胞凋亡，容易導致DIC和感染性休克有關[33]。今后應通過增加樣本類型和樣本量，同時檢測exoU陽性菌株的蛋白表達狀況，進一步探討ExoU與臨床疾病及病情嚴重程度的確切相關性。

6 ExoU與耐藥相關性

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的大量應用、甚至濫用，銅綠假單胞菌耐藥問題日益突出，碳青霉烯類、氟喹諾酮類藥物耐藥成為威脅感染患者生命的重要因素，在南韓59.6%的碳青霉烯類耐藥的銅綠假單胞菌表現為對氟喹諾酮類藥物耐藥[34]。Hye等[11]分析66株碳青霉烯類藥物耐藥的銅綠假單胞菌發現，exoU攜帶率遠高于exoS(66.7% vs30.3%)，與exoS陽性菌株相比exoU陽性菌株對氟喹諾酮藥物具有更高的耐藥率(93.2% vs 45%)，進一步研究發現exoU陽性菌株氟喹諾酮耐藥決定區(QRDRs)多位點突變率高達90.9%，顯著高于exoS陽性菌株的35%，同時攜帶兩種基因的菌株100%屬于多位點變異。Mellissa[35]等分析270株銅綠假單胞菌，其中54%氟喹諾酮耐藥，exoU陽性菌株耐藥率63%，明顯高于exoS陽性菌株的49%，多點突變率顯著高于exoS陽性菌株(53% vs 39%)，突變位點以Thr83lle和Ser87Leu為主，突變率達70%。歐洲的一項調查結果同樣顯示[36]，exoU陽性菌株與銅綠假單胞菌的多藥耐藥性及氟喹諾酮耐藥之間存在明顯相關性，認為可能exoU陽性菌株更能適應氟喹諾酮藥物富集的環境。角膜炎患者分離的銅綠假單胞菌耐藥分析亦顯示[37]，exoU陽性菌株與陰性菌株相比對環丙沙星、慶大霉素、氧氟沙星具有更高的耐藥性。

關于exoU陽性菌株耐藥性更強的詳細機制目前還不清楚，推測可能與下列因素有關：①外排泵系統過度表達：在加有外排泵抑制劑(EPI)時，97%的exoU陽性菌株對左氧氟沙星的MIC值降低至少8倍，其中55%的耐藥菌株重新表現為對氟喹諾酮敏感[35]；②與細菌啟動SOS應答有關：低濃度左氧氟沙星即可啟動細菌的SOS應答，誘導產生具有“錯誤傾向”的DNA修復酶，引起細菌廣泛的基因突變[38]。由此推測，在藥物壓力下exoU陽性菌株在SOS應答中可能更傾向于產生耐藥相關聚合酶，通過耐藥突變的發生使細菌得以存活；③與細菌DNA的拓撲結構有關[35]：某些基因的啟動子對DNA超螺旋狀態的變化高度敏感，超螺旋可能改變啟動子區結構使其進入轉錄、表達狀態，推測exoU陽性菌株可能攜帶有拓撲結構敏感啟動子，氟喹諾酮類藥物作用于細菌的DNA旋轉酶使DNA超螺旋狀態改變，致使細菌拓撲結構敏感的耐藥基因表達。

目前國內有關T3SS及其效應蛋白與細菌耐藥相關性的研究較少，現有的研究資料關于exoU基因和ExoU蛋白與銅綠假單胞菌耐藥是否相關存在分歧。吳愛武等研究認為[10]，銅綠假單胞菌多重耐藥菌株與非多重耐藥菌株exoU攜帶率無顯著性差異(10% vs 11.76%)，多重耐藥菌株exoU基因檢出率明顯低于exoS基因(10% vs 73.33 %)，認為可能與檢測標本量較少，且未檢測基因表達產物有關。安浩君等[39]對感染性心內膜炎患者血標本檢測結果顯示，多重耐藥菌株中exoU基因與exoS基因檢出率相比無顯著差異(42.67% vs 49.33%)。然而，董晨曉等[40]對43株臨床分離銅綠假單胞菌的研究結果與上述觀點相反，結果顯示exoU陽性菌株對臨床常用抗菌藥物耐藥率明顯高于exoS陽性菌株，認為攜帶exoU的菌株有更高的耐藥性。不同研究結果的差異可能與不同地區、不同感染來源的菌株有關，但T3SS效應基因及效應蛋白與耐藥及多重耐藥的關聯應進一步加以深入研究實，以期為多重耐藥菌株感染的控制提供策略。

綜上所述，目前盡管已對銅綠假單胞菌T3SS的毒性蛋白ExoU和其編碼基因exoU的認識和研究取得了很大進展，但許多確切機制仍有待于進一步闡明，如控制ExoU分泌的調控網絡、是否還有未知的激活ExoU發揮毒性效應的共刺激因子、共刺激因子與宿主細胞膜結合靶位如何協同增強毒性作用，以及針對ExoU蛋白分泌、活化的抑制劑篩選問題等，是今后需要不斷努力的方向。

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Research progress of toxic protein ExoU inPseudomonasaeruginosa

JU Xiao-hong1,LI Zheng-hua2,MA Ai-xin1,LI Yao1

(1.DepartmentofPathogen,JilinMedicalCollege,Jilin132013,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theHospitalofChemicalIndustrialCompanyinJilin,Jilin132022,China)

Pseudomonasaeruginosais an important conditioned pathogen with the multitude of virulence factors. Among them, the type Ⅲ secretion system (T3SS) which is the most important pathogenic factors plays a crucial role in the acute infection ofPseudomonasaeruginosa. This system exert cytotoxicity through targeted delivery of protein effector (ExoS, ExoT, ExoU and ExoY) into host cell. In particular, ExoU is a potent cytotoxin closely related to disease development, outcomes and therapy. In this paper, we briefly review research progress on the toxic protein ExoU for recent years, aiming at serving as a guide for infection control and treat ofPseudomonasaeruginosa.

Pseudomonasaeruginosa; type Ⅲ secretion system (T3SS); EoxU; multiple drug resistance; toxic gene

1.吉林醫藥學院病原學教研室，吉林 132013; 2.吉林化工醫院檢驗科，吉林 132001; Email：Lijin838@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.018

R378.99

A

1002-2694(2015)11-1069-06

2015-04-17；

2015-08-21