南繁區水稻病毒病發生情況及分子鑒定

謝海霞等

摘 要 對海南島南部三亞、瓊海、陵水等南繁水稻產區市縣的病毒病發生情況進行調查，同時根據國內外已報道的10種主要水稻病毒設計特異PCR檢測引物，對23個疑似水稻病毒樣品進行分子檢測，結果表明：海南南繁區水稻病毒病主要有2種，即由南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病和由水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）引起的水稻齒葉矮縮病；經分子檢測鑒定了6例南方水稻黑條矮縮病樣品和14例水稻齒葉矮縮病樣品，檢出2個交叉復合感染的樣品，2種病樣的檢出率分別為 26.09%和60.87%，其余8種水稻病毒均未檢測到。研究結果表明，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是南繁水稻種植區域需重點防治的病害對象。

關鍵詞 南繁 ；水稻 ；黑條矮縮病 ；齒葉矮縮病 ；分子鑒定

分類號 S435.111.1

Abstract Circumstance of rice virus disease in southern Hainan island rice-planting areas including Sanya， Qionghai and Lingshui was investigated. Specific primers for 10 known rice virus species were designed for PCR tests. A total of 23 suspected virus-infected samples were tested. Molecular identification results showed that there were two major rice virus species existed in Hainan winter-breeding areas： southern rice black-streaked dwarf virus （SRBSDV） and rice ragged stunt virus （RRSV）. 6 SRBSDV-infected samples and 14 RRSV-infected samples were identified by PCR and sequencing methods. 2 samples were co-infected by both SRBSDV and RRSV. Infection rates of SRBSDV and RRSV were 26.09% and 60.87%， separately. The other 8 viruses were not detected. This study showed that SRBSDV and RRSV are key diseases in Hainan winter-breeding areas and should be carefully prevented.

Keywords Hainan winter-breeding areas ； rice ； SRBSDV ； RRSV ； molecular identification

中國已發現的水稻RNA病毒約有10種[1]，包括水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）、水稻瘤矮病毒（rice gall dwarf virus，RGDV）、水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）、水稻矮縮病毒（rice dwarf virus，RDV）、水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV）、水稻草矮病毒（rice grassy stunt virus，RGSV）、水稻東格魯球狀病毒（rice tungro spherical virus，RTSV）、水稻黃矮病毒（rice yellow stunt virus，RYSV）和水稻黃斑駁病毒（rice yellow mottle virus，RYMV）。由水稻病毒引起的水稻病毒病已成為影響水稻生產的主要病害。20世紀50年代水稻黑條矮縮病首次在中國被報道，90年代后在中國南方水稻產區流行，近年來呈逐年加重的趨勢，造成嚴重的經濟損失[2-4]。其中，南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）是在廣東、海南等地新發現的一種水稻病毒，主要由白背飛虱（Sogatellafurcifera）以持久性方式傳播[5-6]。此外，水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）是危害水稻生產的一種世界性病害，在中國、日本、菲律賓和東南亞地區都有報道。

南繁是指每年9月至次年5月在海南省南部的三亞、樂東、陵水等地從事農作物品種選育、種子生產和種質鑒定等。據不完全統計，全國有30個省（市、自治區）的550多家單位近5 000名科技人員云集于海南南繁區域開展育種工作。南繁育種區域聚集了豐富的水稻種質資源，為水稻品種選育提供了優良的育種材料，已成為中國水稻育制種的“綠色基因庫”[7]。然而，由于南繁區水稻育種材料的匯聚和擴散，南繁區域也極易于成為水稻病毒病害傳播和擴散的源頭，對南繁水稻種業的健康發展構成了潛在的威脅。但目前尚未見關于南繁區水稻病毒病害的報道。鑒于此，本研究調查和鑒定了海南省三亞、陵水、瓊海等水稻種植區域的病毒為害情況，為防治和控制南繁區水稻病毒的為害和傳播提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年1月，在海南島南繁區域（包括三亞、陵水、瓊海等縣市水稻產區）共采集23份水稻疑似病毒病害樣品（表1），每份樣品采集水稻葉片3～5片，編號和記錄后置于冰袋中保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據文獻報道獲得水稻病毒PCR檢測引物信息（表2），或通過GenBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢獲得水稻病毒的mRNA序列信息，利用Primer3軟件（http：//primer3.ut.ee/），采用默認參數設計獲得PCR檢測引物序列（表2）。

1.2.2 總RNA提取及反轉錄

采用Plant RNA Extraction kit試劑盒（TianGen Biotech）提取水稻葉片總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA的完整性，用RNA反轉錄試劑盒（Fermantas）將總RNA反轉錄得到cDNA，用作PCR反應的模板。

1.2.3 PCR檢測

分別用表2中的引物對反轉錄所得到的cDNA進行PCR擴增。反應體系如下：模板cDNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，Ex-Taq 0.25 μL，10× Buffer 2 μL，10 mmol/L 正反引物各0.5 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。PCR擴增條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。PCR結束后，取8 μL產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 克隆轉化

采用DNA回收試劑盒（Sangon）回收PCR產物，將其連接到pMD18-T載體上，12 h后將連接產物轉化大腸桿菌DH5α；12～16 h后，挑取平板上的單菌落接種于含有0.1%氨芐的LB培養液中震蕩培養8 h，然后使用克隆載體通用引物M13-47和RV-M進行菌液PCR；反應結束后取8 μL擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；挑取陽性克隆送上海Sangon公司測序。

1.2.5 序列測定和同源性比較

將測序結果去除低質量序列和污染序列后，登錄GenBank進行BLASTn比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.

cgi），通過序列相似性比較，判斷來源病毒物種名稱。

2 結果與分析

2.1 水稻總RNA的提取

經提取獲得23個水稻葉片樣品的總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，RNA主要集中于100、750、1 500 bp 三個條帶長度，RNA質量較好（OD260/OD280≈2.0），符合RT-PCR試驗的要求（圖1）。

2.2 RT-PCR檢測

獲得樣品總RNA后，經反轉錄獲得cDNA，利用所獲得的PCR引物（表2）對23個疑似病毒樣品依次進行RT-PCR檢測。結果顯示，除SRBSDV和RRSV檢測呈陽性以外，其它病毒引物檢測都為陰性（圖2，3）。

應用南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）引物檢測樣品時，其中NFR3、NFR7、NFR8、NFR9、NFR16、NFR19共6例樣品的檢測顯示為陽性，在600 bp目標區域有明顯的PCR產物條帶（圖2）。23例疑似病害樣品中，南方水稻黑條矮縮病毒檢出率為26.09%。而應用水稻齒葉矮縮病毒（RRSV）引物檢測樣品時，其中NFR2、NFR3、NFR4、NFR5、NFR9、NFR10、NFR12、NFR13、NFR14、 NFR15、NFR20、NFR21 、NFR22、NFR23共14例樣品的檢測顯示為陽性，在700 bp目標區域有明顯的PCR產物條帶（圖3）。23例疑似病害樣品中，水稻齒葉矮縮病毒檢出率達60.87%。檢測結果顯示，NFR3和NFR9 2例樣品在SRBSDV和RRSV引物檢測中均呈陽性，可能同時交叉感染這2種病毒（圖2，3）。

2.3 病毒序列鑒定

通過對PCR檢測為陽性的產物進行回收、克隆轉化和測序鑒定，獲得了PCR擴增產物的核苷酸序列信息，并將其與GenBank數據庫進行BLASTn比對（表3）。鑒定結果顯示，14例樣品為水稻齒葉矮縮病毒感染，6例樣品為南方水稻黑條矮縮病毒感染，其中NFR3和NFR9 2例樣品同時感染了上述2種病毒。結果表明，危害南繁區域水稻的水稻齒葉矮縮病毒為同一種（序列號：GQ329711.1），與此同時，可能存在多個危害南繁區域水稻的南方水稻黑條矮縮病毒變種。

3 討論

本研究基于已知的10種水稻RNA病毒設計了RT-PCR引物，對從南繁區采集的23個疑似病害樣品進行檢測，獲得南方水稻黑條矮縮病毒感染樣品6例、水稻齒葉矮縮病毒感染樣品14例，其中有2例是復合感染的樣品，沒有檢測到其余8種水稻病毒侵染的樣品。已知的10種水稻RNA病毒基因組均屬于雙鏈RNA（dsRNA）類型，在病毒感染的不同時期寄主體內的病毒dsRNA含量發生變化，因此在提取疑似病樣的總RNA時，難以獲得一些病毒dsRNA含量較低的RNA樣品，導致PCR檢測呈陰性。此外，除已報道的10種水稻RNA病毒以外，可能存在未知的病毒種類，由于缺少基因組信息，因此還無法通過PCR檢測到。

本研究結果顯示，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是中國南繁區域危害水稻的2種主要病毒。近年來，南方水稻黑條矮縮病毒已成為危害中國水稻生產的重要病毒，主要在以種植秈稻為主的長江以南地區為害水稻，在南方的13個省份均有報道，造成了嚴重的損失[15]。水稻黑條矮縮病毒主要在長江流域水稻種植區域發生為害，尤其在江蘇地區，水稻黑條矮縮病毒幾乎遍布全省[3]。據報道，這2種病毒可侵染常規粳稻、常規秈稻、雜交粳稻、雜交秈稻、常規糯稻等，生產中尚未見對這2種病毒高抗的水稻類型或品種[11，15-16]。據報道，由于水稻齒葉矮縮病毒病害發病率普遍較低，未廣泛流行，導致該病未得到重視。但是，該病近年在中國南方局部地區已造成比較嚴重的損失，有流行爆發的可能[16]。

鑒于中國海南南繁區域水稻育種材料來源廣泛且易于擴散的特殊性，亟待加強對水稻病毒的檢測和檢疫。本研究結果發現，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是南繁區域目前需要重點防控的病害對象，南繁區域發現的南方水稻黑條矮縮病毒的多樣性較高，可能存在多個變種。鑒于病毒極易產生變異而導致防治困難的特點，建議南繁區域科研單位重點加強對上述2種病毒的檢疫和檢測，預防水稻病毒病的大規模為害。在本研究基礎上，筆者分別研發了用于快速檢測和鑒定南方水稻黑條矮縮病毒、水稻齒葉矮縮病毒的分子檢測試劑盒（待發表），為南繁區域水稻病毒的檢測和防疫提供技術支持。

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