中國湖南漢族人群胰島素樣生長因子-1 rs972936位點單核苷酸多態性與阿爾茨海默病的相關性分析

陳麗穎 杜小平

1.長沙市第四醫院神經內科，湖南長沙410006；2.中南大學湘雅醫院神經內科，湖南長沙410008

中國湖南漢族人群胰島素樣生長因子-1 rs972936位點單核苷酸多態性與阿爾茨海默病的相關性分析

陳麗穎1杜小平2▲

1.長沙市第四醫院神經內科，湖南長沙410006；2.中南大學湘雅醫院神經內科，湖南長沙410008

目的研究部分漢族人群IGF-1 rs972936的單核苷酸多態性與阿爾茨海默病的相關性。方法本研究于2009年4月～2011年12月期間，篩選170例湖南漢族AD患者與147例性別、年齡匹配的健康人群，其IGF-1 rs972936位點的基因型、等位基因采用聚合酶鏈式反應-限制性內切酶片段長度多態性（PCR-RFLP）方法檢測并分析。結果IGF-1 rs972936 GG、AG和AA在兩組間的分布頻率：AD組48.82%、38.23%、12.94%，對照組20.41%、40.82%、38.78%；等位基因G、A分布頻率為：AD組67.94%、32.06%，對照組40.82%、59.18%，以上各頻率分布差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論IGF-1 rs972936的GG基因型、G等位基因可能為湖南漢族人群AD發病的危險因素。

阿爾茨海默??；胰島素樣生長因子-1；單核苷酸多態性；基因

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）為中樞神經系統退行性疾病，以進行性記憶力喪失及認知功能退化為臨床主要表現，多伴有精神癥狀和人格障礙。AD具有三大特征性病理學改變，包括神經纖維纏結、老年斑、海馬錐體細胞顆?？张葑冃?，一般病理改變包括腦室擴大（記憶、語言、海馬區）、腦溝增寬、皮質廣泛萎縮、血管淀粉樣變性、星形膠質細胞反應及大量神經元細胞突觸缺失[1-3]。較之于研究透徹的病理學改變，AD的病因未明、發病機制復雜，眾多復雜的遺傳和環境因素參與其中，近年來又以遺傳易感基因異常為研究熱點，其中早老素1基因、早老素2基因、淀粉樣前體蛋白基因、載脂蛋白Eε4基因為已確定的4種AD易感基因。IGF-1具有強大的神經系統保護作用，通過促進細胞增殖與分化等作用，參與神經變性過程，影響AD發病機制。國外已有研究證明IGF-1 rs972936基因多態性能影響AD患者血清中的IGF-1濃度[4，5]，影響疾病進程，國內尚無相關報道。本研究通過應用聚合酶鏈式反應-限制性內切酶片段長度多態性技術（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）檢測IGF-1 rs972936的單核苷酸多態性，從遺傳易感基因學角度為AD提供分子遺傳學診斷依據，進一步探討IGF-1與AD病理學機制的相互關聯。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本課題所選取的研究對象選自中國湖南地區漢族人群，均簽署知情同意書。研究資料收集時間段為2009～2012年。170例AD患者選自中南大學湘雅醫院附屬一醫院、湘雅附屬二醫院、湖南省第二人民醫院住院患者及長沙市第三福利院，其中病程≤1年7例，1年＜病程＜2年28例，2年≤病程＜3年26例，3年≤病程＜4年27例，4年≤病程＜5年16例，5年≤病程＜6年24例，6≤病程＜10年30例，病程≥10年12例。147例正常健康人群均來自湘雅醫院體檢中心。兩組年齡構成、性別比例均匹配。統計兩組間的性別構成比、起病年齡資料，年齡比較采用t檢驗，性別比較采用χ2檢驗，差異無統計學意義（P均＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 性別及年齡在AD組、正常對照組間的匹配檢測

1.2 納入及排除標準

AD篩選標準：采用《精神障礙診斷標準和統計手冊》（DSM-IV-R），美國神經病學、言語障礙、卒中研究所（NINCDS），阿爾茨海默病及相關疾病協會工作組（NINCDS-ADRDA）診斷標準。依據診斷方法和把握度分三類：明確的AD、可能性大的AD、可能的AD。對“可能的AD”需通過MMSE量表、CDR癡呆登記量表、Hanchiski缺血量表、畫鐘試驗進一步評判。排除標準：突然發病及卒中樣起??；發病或病程早期出現局灶神經功能缺損或癲癇及步態異常；早期錐體外系癥狀或其他內科疾病引起記憶及相關癥狀，包括腦血管病、嚴重抑郁狀態、中毒和代謝異常。

正常健康對照組入組標準：①日常生活各項功能良好；②MMSE量表評分≥27分。排除標準：①存在嚴重軀體疾病、糖尿病、高脂血癥及腫瘤的患者；②MMSE量表評分＜27分。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取采集靜脈血4～5 mL，充分搖勻，乙二胺四乙酸（ethylene-diaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，采用酚、氯仿法提取DNA。

1.3.2 聚合酶鏈式反應（PCR）過程①引物設計與檢測：目標基因的單核苷酸多態性序列應用Gene Bank檢索，Primer Premer 5.0、Blast軟件設計并檢測引物。IGF-1 rs972936位點上游引物：5’-GTGGTATGTGTAGTTATTCTGACATCCAG-3’下游引物：5’GTGTCTGGCTGTGGCTCTTAG 3’。PCR反應體系（共10μL）：10×PCR Buffer 1.0μL，dNTP 0.5μL，gDNA 0.3μL，上、下游引物各0.1 uL，加去離子水補充至10μL。②PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，共20個循環；最后72℃延伸6min。每次提取4～7μL的PCR擴增產物，均勻點樣至2.5%的瓊脂糖凝膠篩孔內，設置150 V電壓、0.5×TBE電泳緩沖液電泳30 min，擴增的PCR產物條帶利用凝膠圖像系統觀察并分析、照相。

1.3.3 酶切過程IGF-1的rs972936位點的酶切反應體系：內切酶MvaI（10U/μL）0.1μL；PCR擴增產物10μL；緩沖液1.5μL；加雙蒸水（ddH2O）至總體積15μL，靜置于37℃恒溫水浴箱并過夜。

1.3.4 電泳過程每次提取4～7μL的PCR酶切產物均勻點樣至3.0%的瓊脂糖凝膠篩孔內，0.5×TBE電泳緩沖液，電泳條件設定為150 V電壓，時間為30 min，每個電泳條帶分別對應的基因型分別呈現于凝膠成像系統，確定并拍照。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件、Excel進行統計學分析及圖表繪制。Hardy-Weinberg平衡檢測法檢測樣本的群體代表性。性別資料用正態變量（x±s）表示，t檢驗用于組間計量資料的比較，χ2檢驗用于組建計數資料的比較。P值取雙側概率，若P＜0.05為差異存在統計學意義。基因計數方法測定IGF-1 rs972936位點的基因型及等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子+雜合子）/（2×受檢人數）。

2 結果

2.1 人群代表性檢驗

應用Hardy-Weinberg平衡法檢測，IGF-1 rs972936基因型、等位基因在AD組的基因分布頻率檢測結果：χ2=2.542，P=1.111，對照組的基因分布頻率檢測結果：χ2=3.54，P=0.06，符合遺傳平衡（P＞0.05）。見表2。

2.2 IGF-1 rs972936位點的酶切產物判定

PCR-RFLP檢測IGF-1 rs972936位點的PCR產物長度為193 bp。含多態性位點鳥嘌呤（G）的基因型可被限制性內切酶MvaI特異性酶解完全，產生125 bp、68 bp兩個片段；含多態性位點腺嘌呤（A）的基因型則不會被酶解。最終電泳后的酶切產物有三種類型：第一型：IGF-1 rs972936位點為AA基因型，僅顯示193 bp一條條帶，產物完全未被酶切；第二型：IGF-1 rs972936位點為GG基因型，顯示125 bp、68 bp兩條條帶，產物被完全酶切；第三型：IGF-1 rs972936位點為AG基因型，顯示193 bp、125 bp、68 bp三條條帶，產物被部分酶切。見圖1。

圖1 IGF-I rs972936位點的PCR酶切產物電泳圖

2.3 IGF-1 rs972936位點的基因型和等位基因分布頻率

GG、AG和AA三種基因型在AD組和對照組總體分布頻率存在統計學意義（χ2=39.102，P=0.000＜0.05），G、A等位基因在兩組間的總體分布頻率亦存在統計學意義（χ2=46.491，P=0.000＜0.05）。見表2。AD組與對照組相比：GG基因型、G等位基因分布頻率顯著增高，AA基因型、A等位基因分布頻率顯著降低，見封三圖1。

表2 IGF-1 rs972936位點的基因型和等位基因頻率分布[n（%）]

3 討論

人類胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）又稱生長介素，為一單鏈堿性多肽，基因編碼產物為IGF-I。IGF-I基因位于第12號染色體，全長90 kb，含有6個外顯子、6個內含子[6]。IGF-1信號肽氨基端序列和羧基端分別由外顯子1、外顯子3的5’端編碼；外顯子3的剩余部分及外顯子4編碼成熟的IGF-1肽鏈段，而翻譯終止碼包含在外顯子5、6內[7]。

IGF-1具有廣泛的中樞神經系統保護作用并維持大腦內環境穩定[8-10]，它能阻止神經細胞凋亡[11，12]、促進神經元血管再生及重塑、減少缺血缺氧對神經元的損害、促進神經髓鞘合成及存活[13]。國外大量研究表明，IGF-1能干預AD病情進展，維持認知功能[14]。AD的特征性病理改變包括Aβ蛋白沉積及磷酸化tau蛋白形成，IGF-1可通過胰島素降解酶（IDE）的競爭性抑制作用間接或直接調節大腦中Aβ蛋白的水平，從而對抗Aβ蛋白毒性[15]。IGF-1/胰島素信號通路可負反饋調節糖原合成激酶-3β（GSK-3β）/磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-p70 S6K通路，減少tau蛋白磷酸化、增加其與微管結合[16]。Schubert和Carro等在動物實驗中證實[17，18]，損壞老鼠大腦中該信號通路可致過度磷酸化tau（Hpf-tau）蛋白形成，伴隨認知功能障礙。此外，IGF-1對AD的影響還包括能提高海馬的神經發生和神經元興奮性、維持突觸可塑性[19]、保護中樞膽堿能系統[20，21]，因此，中樞神經系統中IGF-1濃度下降或基因功能異常與AD發病、病情嚴重程度密切相關。

本研究顯示，IGF-1 rs972936的AA、AG、GG三種基因型在AD組及對照組的頻率分布顯示：12.94%、38.23%、48.82%；38.78%、40.82%、20.41%。A、G等位基因在AD組、對照組的頻率分布顯示：32.06%，67.94%；59.18%，40.82%，χ2檢驗顯示基因型、等位基因在兩組間的分布均存在統計學意義，AD組與對照組相比，GG基因型、G等位基因分布頻率顯著增高，AA基因型、A等位基因分步頻率則顯著低于對照組。進一步推論，GG基因型、G等位基因為致AD發病的危險因素，即攜帶GG基因型、G等位基因人群的AD患病風險顯著增高；而攜帶AA基因型和A等位基因人群的AD患病風險則顯著降低，為AD發病的保護因素。

基因多態性產生的原因為單核苷酸變異，其本質是DNA核苷酸排列順序的差異?；蛲蛔儼l生于外顯子、啟動子、編碼區內，則可轉錄產生錯誤的mRNA片段、或影響轉錄速度，改變蛋白質活性或合成沒有活性的蛋白質?；蚍蔷幋a區的突變對基因功能無明顯改變。

IGF-1 rs972936位點位于基因內含子區域，主要調節基因剪接點部位的活性。Teo Vargas[22]等證實了IGF-1 rs972936基因多態性與外周血循環中的IGF-1濃度相關，AD組高于正常對照組，其中攜帶GG基因型及G等位基因AD患者血清的IGF-1濃度高于AG、AA基因型及攜帶A等位基因的患者（[GG]（143.9± 8.6）ng/m L vs[GA]（115.2±9.2）ng/m L P=0.027，[AA]（95.8± 14.6）ng/mL，P=0.015）。隨年齡增長，血腦屏障及IGF-1信號通路功能下降[23，24]，大腦血管、脈絡叢的功能受到干擾，致IGF-1敏感性降低[25]，表現為外周循環的IGF-1濃度代償性增高而中樞濃度下降（即IGF-1抵抗），最終導致大腦中Aβ蛋白清除減少、過度磷酸化tau蛋白形成，最終誘發AD。因此，推測IGF-1 rs972936位點的基因多態性可能通過以下途徑影響AD的發病：GG基因型、G等位基因能干擾正?；蚬δ?，并通過改變基因剪接位點的活性，致IGF-1信號通路受損，從而產生IGF-1抵抗、IGF-1敏感性降低，導致中樞IGF-1濃度下降而外周循環代償性增高；信號通路受損后，GSK-3β通路所受的負反饋抑制作用降低，磷酸化tau蛋白增多，中樞的Aβ蛋白清除減少、沉積增多，誘發AD。除此之外，外周循環中的IGF-1透過血腦屏障需借助于IGF載體蛋白（IGFBPS），并同時結合IGF-1R才能作用于中樞神經系統，因而不能排除IGF-1 rs972936位點多態性對IGFBPS、IGF-1R產生的干擾作用，阻礙IGF-1透過血腦屏障，致使其中樞神經系統濃度降低。本實驗由于條件限制，未能進一步測定AD患者和正常對照組外周循環中的IGF-1濃度，因此，以上作用機制的推論僅為猜測，關于IGF-1 rs972936位點的單核苷酸多態性究竟如何改變AD的易感性，仍有待深入研究與探討。

[1]雷春濤，樊映川，張學東.IGF-1系統與糖尿病視網膜病變的研究進展[J].重慶醫學，2007，8（36）：1554-1556.

[2]Rotwein P，Burgess SK，Milbrandt JD，et al.Differential expression of insulin-like growth factor genes in rat centralnervous system[J].Proc Natl Acad Sci，1988，85（1）：265-269.

[3]Duan C，Xu Q.Roles of insulin-like growth factor（IGF）binding proteins in regulating IGF actions[J].Gen Comp Endocrinol，2005，142（1-2）：44-52.

[4]Vardy ER，Rice PJ，Bowie PC，et al.Increased circulating insulin-like growth factor-I in late-onset Alzheimer's disease[J].Alzheimers Dis，2007，12（4）：285-290.

[5]Salehi Z，Mashayekhi F，Naji M.Insulin like growth factor-1 and insulin like growth factor binding proteins in the cerebrospinal fluid and serum from patients with Alzheimer’s disease[J].Biofactors，2008，33（2）：99-106.

[6]Butterfield DA，Reed T，Newman SF，et al.Roles of amyloidβpeptide associated oxidative stress and brain proteinmodifications in the pathogenesis of Alzheimer’s，ease and mild cognitive impairment[J].Free Radic BiolMed，2007，43（5）：658-677.

[7]Shi L，Linville MC，Tucker EW，et al.Differential effects of aging and insulin-like growth factor-1 on synapses in CA1 of rat hippocampus[J].Cereb Cortex，2005，15（5）：571-577.

[8]Torres-Aleman I.Toward a comprehensive neurobiology of IGF-I[J].Dev Neurobiol，2010，70（5）：384-396.

[9]Zhao X，Liu SJ，Zhang J，et al.Combining insulin-like growth factor derivatives plus caffeinol produces robust neuroprotection after stroke in rats[J].Stroke，2005，36（1）：129-134.

[10]Calikoglu A，Karayal A，D’Ercola A.Nutritional regulation of IGF-I expression during brain development in mice[J].Pediatr Res，2001，49（2）：197-202.

[11]Sell C，Baserga R，Rubin R.Insulin-like growth factor I IGF-Iand the IGF-I receptor prevent etoposide-induced apoptosis[J].Cancer Res，1995，55（2）：303-306.

[12]Singleton JR，Randolph AE，Feldman EL.Insulin-like growth factor I receptor prevents apoptosis and enhances neuroblastoma tumorigenesis[J].Cancer Res，1996，（56）：4522-4529.

[13]Carro E，Trejo JL，Busiguina S，et al.Circulating insulinlike growth factor-I mediates the protective effects of physicalexercise againstbrain insultsof differentetiology and anatomy[J].JNeurosci，2001，21（5）：5678-5684.

[14]Van Dam PS，Aleman A.Insulin-like growth factor-I，cognition and brain aging[J].Eur JPharmacol，2004，490（1-3）：87-95.

[15]Reinhardt RR，Bondy CA.Insulin-like growth factors cross the blood-brain barrier[J].Endocrinology，1994，135（5）：1753-1761.

[16]Hong M，Lee VM.Insulin and insulin-like growth factor-1 regulate tau phosphorylation in cultured human neurons[J].Biol Chem，2007，272（31）：19547-19553.

[17]Schubert M，Brazil DP，Burks DJ，et al.Insulin receptor substrate-2 deficiency impairs brain growth and promotes tau phosphorylation[J].JNeurosci，2003，23（18）：7084-7092.

[18]Carro E，Trejo JL，Gerber A，et al.Therapeutic actions of insulin-like growth factor I on APP/PS2 mice with severe brain amyloidosis[J].Neurobiol Aging，2006，27（9）：1250-1257.

[19]Nu觡ez A，Carro E，Torres-Aleman I.Insulin-like growth factor I modifies electrophysiological properties of rat brain stem neurons[J].JNeurophysiol，2003，89（6）：3008-3017.

[20]Aberg MA，Aberg ND，Hedb覿cker H，et al.Peripheral infusion of IGF-I selectively induces neurogenesis in the adult rat hippocampus[J].JNeurosci，2000，20（8）：2896-2903.

[21]Trejo JL，Carro E，Torres-Aleman I.Circulating insulinlike growth factor Imediates exercise-induced increases in the number ofnew neurons in the adulthippocampus[J]. JNeurosci，2001，21（5）：1628-1634.

[22]Vargas T，Martinez-Garcia A，Antequera D，et al.IGF-I gene variability is associated with an increased risk for AD[J].Neurobiol aging，2011，32（3）：3-11.

[23]Ridley AJ，Schwartz MA，Burridge K，et al.Cell migration：inte-grating signals from front to back[J].Science，2003，302（5651）：1704-1709.

[24]Strazielle N，Ghersi-Egea JF.Choroid plexus in the centralnervoussystem：biologyand physiopathology[J].JNeuropathol Exp Neurol，2000，59（7）：561-574.

[25]Tham A，Nordberg A，Grissom FE，et al.Insulin-like growth factors and insulin-like growth factor binding proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with dementia of the Alzheimer type[J].JNeural Transm Park Dis Dement Sect，1993，5（3）：165-176.

Correlation analysis on insulin-like grow th factor-1 rs972936 single nueleotide polymorphism among Chinese Han population in Hu’nan w ith Alzheimer's disease

CHEN Liying1DU Xiaoping2
1.Department of Neurology,Changsha Fourth Hospital,Changsha 410006,China;2.Department of Neurology,Central South University Xiangya Hospital,Changsha 410008,China

ObjectiveTo investigate the relation between IGF-1 rs972936 single nueleotide polymorphism in some Chinese Han population and Alzheimer's disease.M ethods170 AD patients of Chinese Han population in Hunan and 147 healthy volunteerswith matched genders and ageswere sleeved during April 2009 and December 2011.The genotype and allele of IGF-1 rs972936 were detected and analyzed by PCR-RFLP.ResultsThe distribution frequencies of IGF-1 rs972936 GG,AG,and AA were 48.82%,38.23%,and 12.94%in the AD group,and 20.41%,40.82%,and 38.78%in the control group.The distribution frequencies of alleles G and A were 67.94%and 32.06%in the AD group,and 40.82%and 59.18%in the control group.The above differences in distribution frequencieswere all statistically significant(P＜0.05).ConclusionGenotype of GG and allele G of IGF-1 rs972936 are probably risk factors of AD in Chinese Han population in Hunan.

Alzheimer's disease;Insulin-like growth factor-1;Single nueleotide polymorphism;Gene

R346

A

1673-9701（2015）36-0017-04

2015-10-15）

▲通訊作者