索拉非尼聯合塞來昔布在體外對肝癌HepG2細胞的影響

周善學，葉小磊，趙亞榮，應福明，馮雪峰，范天逸，李賢杰

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索拉非尼聯合塞來昔布在體外對肝癌HepG2細胞的影響

周善學1，葉小磊2，趙亞榮2，應福明1，馮雪峰1，范天逸1，李賢杰1

目的 研究索拉非尼聯合塞來昔布在體外對肝癌HepG2細胞增殖的影響。方法以不同濃度索拉非尼和塞來昔布分別組成單藥組和聯合用藥組作用于HepG2細胞，MTT法檢測增殖抑制率，流式細胞儀檢測細胞周期。Western blot檢測Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4蛋白的表達。結果索拉非尼、塞來昔布單藥與聯用均能抑制HepG2細胞增殖，呈時間-劑量依賴效應，兩藥聯用有協同效應(P<0.05)。藥物組與空白組相比，G0/G1期細胞比例增高，聯合用藥組最高。聯合用藥組與單藥及空白對照組相比，HepG2細胞中Cyclin D1、Cyclin D3蛋白的表達顯著降低。結論索拉非尼聯合塞來昔布可能通過下調Cyclin D1、Cyclin D3表達，增強G0/G1期阻滯，發揮協同抑制HepG2細胞增殖的作用。

索拉非尼；塞來昔布；肝癌細胞

0 引言

肝癌的發病機制非常復雜，其形成、發展和轉移與多種基因的突變、細胞信號轉導通路和新生血管增生異常等密切相關，其中存在著多個關鍵性環節。索拉非尼(Sorafenib)是口服多靶點、多激酶抑制劑，具有同時抑制腫瘤細胞增殖和血管生成的雙重作用[1-2]。COX-2蛋白在人肝細胞癌中的表達明顯高于癌旁組織，而正常肝組織中多無表達[3]；COX-2蛋白與癌細胞的分化程度、轉移、復發密切相關[4]，有望成為預防、治療腫瘤的靶點。塞來昔布是美國FDA第一個批準的選擇性COX-2抑制劑，可有效地抑制腫瘤引起的輕中度疼痛，對消化道毒副反應小、安全性好[5]。聯合應用索拉非尼及塞來昔布有望更加有效地抑制肝癌的進展，同時緩解癌性疼痛。因此，我們通過索拉非尼聯合塞來昔布作用肝癌細胞的研究探討：①兩藥聯用在體外是否存在協同抑制肝癌細胞增殖的作用；②兩藥聯用對肝癌細胞周期的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與培養 人類肝癌細胞株HepG2細胞(購自中科院生化所)，在寧波市醫學科學研究所中心實驗科液氮凍存。使用前復蘇并常規培養在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，置于37 ℃恒溫、5% CO2飽和濕度環境的培養箱中培養。

1.2 實驗藥品 索拉菲尼(德國拜耳醫藥保健公司產品，商品名:Nexavar，多吉美)，塞來昔布(輝瑞制藥有限公司產品，商品名:Celecoxib，西樂葆)。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期HepG2細胞，以5×104個/mL的細胞密度接種于96孔板，100 μL/孔。37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養24 h后，棄去培養液，加入含有不同濃度索拉菲尼(0、5、10、20 μmol/L)和塞來西布(0、25、50、100、200 μmol/L)的培養液，每個濃度3個復孔，終體積200 μL/孔。分別培養24、48、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL)，在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續孵育3 h后，棄去孔內培養液，每孔加入200 μL DMSO，檢測570 nm處的吸光度值(OD值)，并用630 nm處進行校正。細胞抑制率(%)=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期 將HepG2細胞分10 cm dish，培養24 h后，50 μmol/L塞來昔布、10 μmol/L索拉非尼分別以及兩者聯合作用48 h。收集細胞，調整細胞密度為1×107/mL。用PBS洗1遍，然后加入1 mL預冷70%乙醇，4 ℃固定30 min。用PBS洗1遍，加入500 μL PBS及10 μL RNase(1 mg/mL)，置于37 ℃，30 min。加入500 μL PBS以及20 μL PI染色液(2.5 mg/mL)，避光染色30 min。細胞上機之前過300目篩網，然后檢測。

1.5 Western blot檢測細胞周期蛋白 將HepG2細胞分6孔板，培養24 h后，50 μmol/L塞來昔布、10 μmol/L索拉非尼分別及兩者聯合作用48 h。提取蛋白后，檢測Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4蛋白表達情況。具體操作如下：取25 μg細胞裂解液進行SDS-PAGE，然后轉膜，封閉，抗體孵育。使用ECL發光液，壓片。條帶使用IMAGE J處理，并使用內參β-tubulin進行校正。

1.6 統計學分析 采用統計軟件SPSS 13.0進行分析，數據以表示。均數比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗。交互效應分析采用兩因素多水平的析因設計，P<0.05為差異有統計學意義。協同性分析用金正均q值法[6]判斷，q=實際聯合藥效R′(A+B)/理論聯合藥效R(A+B)，R(A+B)=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨用藥藥效。q<0.85為拮抗，0.85≤q<1.15為相加，q≥1.15為協同。所有實驗均至少重復3次。

2 實驗結果

2.1 顯微鏡形態學觀察(×100) 對照組細胞：呈延展扁平，貼壁生長，細胞間排列緊密，密度均勻(見圖1a)。單藥處理組細胞：形態發生變化，細胞輪廓增強，細胞間接觸變松，部分貼壁細胞變圓、漂浮(圖1b、圖1c)。聯合藥物處理組細胞：形態變化，細胞輪廓增強，細胞體積變小、變圓，漂浮的比例增大，細胞周圍碎片增多，細胞數目減少(圖1d)。

圖1 顯微鏡形態學(×100)

2.2 MTT試驗 塞來昔布與索拉非尼單藥及聯用各組均能抑制HepG2細胞生長，表現為時間-劑量依賴效應。聯用組細胞抑制率較單藥組明顯增強。見表1～表3。

統計學結果顯示，塞來昔布和索拉非尼不同劑量抑制效果不同，兩種藥物間存在交互作用(P<0.01)。以金正鈞公式計算不同劑量聯合用藥時的q值，塞來昔布和索拉非尼聯合作用24 h主要表現為相加作用，而聯合作用48及72 h表現出明顯的協同作用。見表4。

表1 塞來昔布聯合索拉非尼作用HepG2細胞24 h抑制率(%)

表2 塞來昔布聯合索拉非尼作用HepG2細胞48 h抑制率(%)

表3 塞來昔布聯合索拉非尼作用HepG2細胞72 h抑制率(%)

表4 不同濃度塞來昔布與索拉非尼聯合作用的q值

2.3 流式細胞儀檢測不同組細胞周期 與空白對照組比較，各藥物組細胞周期中G0/G1期細胞比例增多，G2/M期細胞比例減少。與其他三組比較，聯合用藥組G0/G1期細胞比例最高，G2/M期細胞比例最低。提示聯合用藥主要增加了G0/G1期細胞阻滯(P<0.05)。見圖2。

圖2 塞來昔布，索拉非尼及聯合用藥48 h后HepG2細胞周期比例

2.4 Western blot檢測細胞周期蛋白 聯合用藥組Cyclin D1、Cyclin D3蛋白表達水平較其他組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。各組CDK4的表達無顯著改變。見圖3。表明塞來昔布聯合索拉菲尼能顯著下調HepG2細胞中Cyclin D1、Cyclin D3表達。

圖3 塞來昔布和索拉菲尼單藥與聯合作用于HepG2細胞后Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4的表達

索拉非尼聯合塞來昔布對肝癌HepG2細胞有協同抑制作用。聯合用藥與單藥相比細胞周期阻滯有顯著差異。聯合用藥組與單藥及對照組相比，Cyclin D1、Cyclin D3蛋白的表達下降差異有統計學意義。

3 討論

索拉非尼通過抑制受體酪氨酸激酶KIT、FLT23以及Raf/MEK/ERK途徑中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤細胞增生[7]；同時通過上游抑制受體酪氨酸激酶VEGFR、PDGFR及下游抑制Raf/MEK/ERK途徑中絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤新生血管形成;起到抗腫瘤細胞增殖和抗血管生成的雙重作用[8]。

COX-2蛋白可增強腫瘤細胞侵襲性，抑制凋亡，抑制機體免疫反應[9]，促進血管和淋巴管生成，促進腫瘤的生長和轉移。選擇性COX-2抑制劑主要通過抑制COX-2的活性，從而抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡[10]，抑制腫瘤新生血管生成[11]。研究發現，塞來昔布可以抑制COX-2的合成，阻滯肝癌QGY-7701細胞G1-S期的轉化[12]；也可以抑制HepG2細胞NF-κB因子DNA結合活性和NF-κB因子P65蛋白的表達[13]。因此，塞來昔布的抗腫瘤能力并不完全取決于是否抑制COX-2的表達[14]。

索拉非尼和塞來昔布聯合促進細胞凋亡的機制爭論較多。有研究發現，塞來昔布聯合索拉非尼在體外能夠明顯抑制肝癌SNU-449細胞增殖，機制可能是塞來昔布通過抑制IL-6/STAT3通路，減少STAT3下游表達基因，如Bcl-2、Bcl-XL和Survivin等，從而增強與其他抗癌藥物聯用時的效果[15]。也有研究認為，索拉非尼和塞來昔布聯合能增強對肝癌細胞株HepG2、Huh7的毒性，使細胞凋亡增加；機制可能是通過PI3K-AKT抑制途徑和RAS/RAF/MEK抑制途徑相互作用[16]。

本研究發現，索拉非尼聯合塞來昔布能協同抑制HepG2細胞增殖。從細胞周期分布來看，塞來昔布、索拉非尼抑制細胞生長，使細胞停滯在G0/G1期；聯合用藥后HepG2細胞G0/G1期阻滯更加明顯。索拉非尼聯合塞來昔布可能通過抑制HepG2中Cyclin D1、D3表達，增強G0/G1期細胞阻滯，抑制細胞增殖。

細胞周期的正常進行有賴于CDK與細胞周期蛋白Cyclin組成的一類蛋白復合物的調節。細胞周期蛋白D(Cyclin D)是G1/S期轉換的重要正性調控因子，是G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白[17]，包括3個亞型:Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3。研究發現，肝癌組織中Cyclin D1顯著高于正常肝組織及癌旁硬化肝組織，Cyclin D1的表達與腫瘤包膜的完整性、分化程度，腫瘤的臨床分期及預后相關[18]。Cyclin D1過度表達使細胞周期G1/S期轉換時間縮短，導致細胞增殖失控，引起癌變[19]。Cyclin D3通過與CDK4或CDK6結合，使Rb蛋白發生磷酸化，促進與DNA合成有關的基因轉錄，促進細胞周期[20]。Cyclin D3/CDK4或CDK6復合體和Rb蛋白的磷酸化失活可能不僅僅是細胞進入細胞周期運行的必要因素，同時也是決定細胞凋亡是否能發生的關鍵。因此，Cyclin D1、D3表達下調，可能是索拉非尼聯合塞來昔布協同抑制HepG2細胞增殖的機制之一。索拉非尼和塞來昔布在肝癌細胞之間的協同作用有望減少索拉非尼的高額成本，降低手足綜合征、血壓升高、脫發、腹瀉、疲乏、骨髓抑制及腎功能損害等潛在的不良事件發生率。

本研究提示，塞來昔布能協同增加索拉非尼的抗肝癌效果，減少索拉非尼劑量并減輕其毒副作用。但是兩藥聯合的協同作用的具體機制仍在深入研究，臨床應用前仍需有待進一步動物實驗，明確應用范圍及安全劑量。

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Effect of sorafenib and celecoxib combination therapy on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2invitro

ZHOU Shan-xue1，YE Xiao-lei2，ZHAO Ya-rong2，YING Fu-ming1，FENG Xue-feng1，FAN Tian-yi1，LI Xian-jie1

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,The Affiliated Hospital of School of Medicine of Ningbo University，Ningbo 315020,China; 2.Ningbo Institute of Medical Sciences，Ningbo 315020，China)

Objective To investigate the effect of sorafenib and celecoxib combination therapy on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2.MethodsHepG2 cells were treated with different concertrations of sorafenib or celecoxib alone or their combination.The inhibitory effects were detected by MTT assay.Cell cycles were analyzed by flow cytometry in different groups.The expressions of cell cycle related proteins Cyclin D1,Cyclin D3,CDK4 were evaluated by Western blot.ResultsSorafenib or celecoxib used alone or combination inhibited the proliferation of HepG2 cells in a time- and dose-dependent manner,and a synergistic effects was observed in their combined action (P<0.05).G0/G1phase cell proportion in medication groups was higher than that in blank group,and G0/G1phase cell proportion in combination group was the highest.Compared with single drug or blank control group,the combination use could significantly inhibit Cyclin D1 and Cyclin D3 expression in HepG2 cell.ConclusionThe combination of sorafenib with celecoxib can inhibit Cyclin D1 and Cyclin D3 expression,increase the G0/G1phase retardation,and play a synergistic inhibitory effect for HepG2 cells.

Sorafenib; Celecoxib; Hepatoma cell

2014-09-21

1.寧波大學醫學院附屬醫院肝膽外科，浙江 寧波 315020；2.寧波市醫學科學研究所，浙江 寧波 315020

寧波大學醫學院附屬醫院醫學科技計劃項目(xyy11021)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505005