難溶有機化合物分子質量的測定

歐燕飛, 林志為

(廈門大學 a.分析測試中心; b.化學化工學院，福建 廈門 361005)

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難溶有機化合物分子質量的測定

歐燕飛a, 林志為b

(廈門大學 a.分析測試中心; b.化學化工學院，福建 廈門 361005)

介紹如何對基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)的樣品靶進行加工改造，并針對不同類型的樣品，如難溶有機物、金屬配合物、高聚物、稠環芳烴或富勒烯、簇合物、揮發性差的液體等。采用不同的制樣方式，提供了一種操作簡便、通用性強的檢測分子質量的表征方法，彌補了這些復雜化合物難以獲得準確分子質量的不足，為解析這些化合物結構信息提供有力證據。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜； 質譜； 難溶物質

0 引 言

20世紀80年代末發展起來的基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀(Matrix-Assisted Laser Desorption Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)是激光電離技術和高速數據采集處理系統相結合的產物，它具有高靈敏度、高通量、快速、準確、耐鹽量高等特點，已成功應用于蛋白質、DNA/RNA、多糖等生物大分子的檢測，并獲得了2002年的諾貝爾化學獎[1-9]。

MALDI-TOF-MS的原理是是將微量樣品與過量小分子基質的混合液體點到樣品靶上，經加熱或者風吹干形成共結晶，放入離子源室內，達到一定真空后，激光照射到靶上樣品，基質從激光中吸收能量，傳遞給樣品分子，使其瞬間汽化，并將質子轉移到樣品分子使其離子化。然后進入飛行時間質量分析器，根據它們各自的質荷比(m/z)進行檢測，處理數據后得到質譜圖。其中的基質是一種可通過其分子的光激發或光離子化作用而把質子轉移給分析物，從而加強分析物分子離子形成的物質。在MALDI中基質起到的作用主要如下：① 吸收激光能量并把能量轉移給分析物。這樣不僅可把能量轉移給分析物使其形成分子、離子，還可避免由于過量的能量使分析物裂解；② 包埋分析物，使分析物分子之間彼此隔離，避免分析物分子之間的締合，這種締合會導致質量的復雜化，以至無法進行解吸；③ 適當的基質還會通過其分子的光激發或光離子化作用而把質子轉移給分析物，從而加強分析物分子離子的形成。常用的基質有а-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、2,4,6-三羥基苯乙酮(THAP)、蒽三酚(DI)、3-吲哚丙烯酸(IAA)等。采用MALDI-TOF-MS檢測分子質量具有以下優勢：① 除檢測問題以外，m/z范圍無限制；② 無需精選狹縫，不用掃描就能在同時間檢測整個m/z范圍的離子；③ 離子傳送效率高。此外，MALDI是一種軟電離技術，在線性模式下不產生或者產生很少的碎片離子，可直接應用于混合物分析，也可用來檢測樣品中是否含有雜原子及雜質分子質量[10-11]。

傳統的分析方法需要將基質和樣品分別溶解并配制成一定比例的溶液，再把兩種溶液按照不同濃度的比例混合后進行測試，但是這個比例的大小往往很難把握，使得樣品制備具有難度，對操作者的經驗要求高[12-17]。并且，有一部分樣品在各種溶劑中十分難溶解，或者可溶解的溶劑揮發性差，如甲基亞砜(DMSO)，甚至有些樣品在溶劑溶解后失去原有的性質，這些都不適合樣品以液體形式與基質的溶液混合后在靶上吹干共結晶。

本文對MALDI-TOF-MS配備的樣品靶進行了加工改進，并針對不溶有機物做了大量實驗，總結出幾種制樣方法。以某化合物為例，介紹如何采用MALDI-TOF-MS檢測在氣相質譜(GC-MS)、液相質譜(LC-MS)，包括常用的質譜離子源如電子轟擊電離源(EI)、化學電離源(CI)、電噴霧電離源(ESI)、大氣壓化學電離源(APCI)等所不能適用的難溶化合物的分子質量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MicroFlex MALDI-TOF-MS，美國布魯克公司，配有96個點的Micro SCOUT Plate(MSP)樣品靶；盒式N2激光器，激光波長337 nm，頻率60 Hz，反射正離子模式檢測。

2,5-二羥基苯甲酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸、蒽三酚等基質由布魯克公司提供。

1.2 實驗方法

取樣品靶于鉆床上鉆出直徑φ1～2 mm、深度0.5～1.0 mm的小圓孔(見圖1中虛箭頭所示)，洗凈后用丙酮、乙醇、超純水各超聲波清洗15 min，電吹風或者干燥箱烘干。將裝有樣品的靶放入離子源室內，抽真空至0.3～0.5 mPa，設置電壓Ion Source1為18.0～21.0 kV，Ion Source2為16.0～19.0 kV，lens 9.0～10.0 kV。調節激光能量大小，采集圖譜。

圖1 經加工的樣品靶(…空的孔洞，—孔洞中已填充)

2 結果與討論

對于不同性質的復雜化合物，可以有以下幾種制備方法：① 對于固體樣品，如金屬有機配合物、高分子聚合物、籠狀簇合物等等，先用瑪瑙研缽研至粉末狀，將此粉末與基質或碳納米管充分混合后填滿孔洞中。并用干凈的載玻片壓實，使樣品的表面與靶面平齊(見圖1中實箭頭所示)。② 如果是含有多苯環結構的固體有機化合物，可不加入基質，直接在孔洞中填充滿，壓實。③ 固體塊狀物，如晶體，可直接用2 μL不揮發的甘油或者具有黏性的物質使之在孔內固定，保持樣品的表面與靶表面平齊。④ 有顆粒懸浮于溶劑中的樣品可用移液槍取出5 μL，與5 μL基質溶液混勻后，撈出2 μL，置于微測板樣品靶上，用電吹風吹干，再用載玻片壓結實，除去周邊分散的不牢固的散狀顆粒。針對上述幾類化合物，結合DHB、CHCA等基質，分別摸索了各類化合物的最佳測試條件和參數，做了大量的實驗，均獲得較為理想的譜圖。以某化合物為例，經過實驗，發現該化合物不溶于甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿等常見溶劑，于是將其分散在乙醇中形成懸浮液，用蒽三酚(DIT)作為基質，以方法④制樣，測試后得到了如圖2所示的一系列譜峰。它們分別是該化合物的單體準分子離子峰[M+H]+m/z696.1；二聚體[2M+H]+m/z1 392.9；三聚體[3M+H]+m/z2 088.7；四聚體[4M+H]+m/z2 784.9。

圖2 某化合物采用固體上樣法測得的MALDI-TOF-MS譜圖

相對現有以液相或者氣相進樣的技術，固體進樣法有如下優點和效果：

(1) 難溶有機物，尤其帶有稠環的有機物或富勒烯，可不需要基質，直接用固體上樣，方便快捷，并且減少了基質峰的干擾。

(2) 某些樣品雖然可溶解，溶劑卻很難揮發，如DMSO是一種重要的極性非質子溶劑，但揮發性差，需要大量時間才可除去溶劑，采用文中所述的方法，可以節約大量時間。

(3) 復雜固體化合物，無法用有機溶劑溶解，不能以液體形式點靶，如果用甘油固定住的進樣方法，可在不破壞化合物性質的前提下，獲得可靠的譜圖。

(4) 各類基質都有可能出現[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+、[2M+Na]+等一系列峰，干擾了本身m/z在1 000以內的小分子化合物的譜峰，使得難以分辨和解析。因此，對于小分子(m/z<1 000)的化合物，可以將樣品與碳納米管等充分混勻，再填充于靶上小孔中或者直接在靶上壓片，有效避免了基質各類峰的干擾，同時壓實后碳納米管等固體物不易疏松掉落，并不影響真空系統。

值得一提的是，由于在不同樣品中基質發揮的效果不同，因此優化基質是非常必要的，這樣可以改善結晶狀況，使樣品分布均勻并有效解吸電離，增強質譜信號，進而提高分析靈敏度、分辨率和重復性等[10]。

3 結 語

文中對樣品靶加工改進，為難溶有機物、稠環芳烴、揮發性差的液體等物質提供了檢測分子質量的方法，彌補了這些復雜化合物難以獲得準確分子質量的不足，為解析這些化合物結構信息提供了有力證據，這一結果對此類化合物的合成思路及實驗設計具有十分重要的指導意義。但是不同性質的物質需要選擇不同的基質，基質是否合適決定了實驗的成敗，因此選擇最佳的基質和優化實驗條件仍然是實驗的關鍵。

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Determination of Molecular Mass of Insoluble Organic Compounds

OUYan-feia,LINZhi-weib

(a. Analyzing and Testing Center; b. College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer(MALDI-TOF-MS) has very advantages such as less sample volume, fast detection, resistant to high salt content. Hence it has been widely used in biological molecules, polymers, organic compounds and so on, and generally is mixed with a certain proportion matrix after dissolving samples. In practice, some samples are extremely difficult to dissolve, or cannot find suitable solvent, so they cannot be used by the traditional method to obtain molecular weight on CGMS or LCMS. This paper presented to transform MALDI-TOF-MS sample target for different types of samples, such as insoluble organic compounds, metal complexes, polymers, polycyclic aromatic hydrocarbons or fullerene clusters. With different preparation methods, a convenient method of molecular detection was provided to obtain the accurate molecular mass. The method provides strong evidence for the analysis of the structure information.

matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS); mass spectrometry; insoluble material

2014-03-14

歐燕飛(1966-)，女，廣東茂名人，工程師，現主要從事公共檢測平臺管理和貴重儀器設備的應用與研究，以及計量認證工作。

Tel.: 0592-2188336；E-mail: oyf@xmu.edu.cn

林志為(1977-)，女，福建永春人，碩士，工程師，現主要從事MALDI-TOF-MS與FT-ICR-MS的應用與管理。

Tel.: 0592-2188712；E-mail: zwlin123@xmu.edu.cn

O 621.4

A

1006-7167(2015)01-0060-03