大建中湯對(duì)脾陽(yáng)虛腹痛大鼠CaMKⅡmRNA的影響*

大建中湯對(duì)脾陽(yáng)虛腹痛大鼠CaMKⅡmRNA的影響*

★武靜*黃順

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院貴陽(yáng) 550001)

摘要：目的：觀察大建中湯對(duì)脾陽(yáng)虛疼痛大鼠大腦中環(huán)氧合酶-2(COX-2)mRNA的影響，探討大建中湯對(duì)脾陽(yáng)虛疼痛的作用機(jī)理。方法：將SD大鼠40只隨機(jī)分為正常組、模型組、大建中湯大、小劑量組各10只，采用綜合造模法制備脾虛動(dòng)物模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組以灌胃形式進(jìn)行給藥，各組大鼠連續(xù)給藥15天后，斷頸處死大鼠并立即取腦組織。用RT-PCR法分析檢測(cè)腦組織CaMKⅡmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，脾陽(yáng)虛模型組大鼠大腦CaMKⅡmRNA表達(dá)明顯增加，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)；大建中湯高劑量組CaMKⅡ表達(dá)與模型組相比明顯下降，具有顯著性差異(P﹤0.01)。結(jié)論：CaMKⅡmRNA在脾陽(yáng)虛疼痛中高表達(dá)，大建中湯可抑制脾陽(yáng)虛疼痛大鼠大腦中CaMKⅡ的表達(dá)，并可能通過(guò)此抑制作用來(lái)達(dá)到治療疼痛的目的。

關(guān)鍵詞：大建中湯；脾陽(yáng)虛；大鼠；環(huán)氧合酶-2；RT-PCR

躲避疼痛是機(jī)體對(duì)有害刺激的一種生理現(xiàn)象，然而對(duì)于長(zhǎng)期性的慢性疼痛以及嚴(yán)重的病理性疼痛會(huì)明顯降低患者的生活質(zhì)量。Ca2+/ 鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ) 是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，現(xiàn)已被證實(shí)其是神經(jīng)元突觸后致密物(SD)的主要成分，參與痛覺(jué)過(guò)敏的形成。而大建中湯是臨床治療脾陽(yáng)虛疼痛的經(jīng)典方劑，對(duì)陽(yáng)虛引起的疼痛療效確切，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大建中湯治療脾陽(yáng)虛動(dòng)物模型，了解大建中湯治療后CaMKⅡ的變化，明確該傳統(tǒng)方劑對(duì)疼痛治療發(fā)揮作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 40只清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g(由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供。置于安靜，溫度恒定(22±2)oC環(huán)境中飼養(yǎng)3d。隨機(jī)分為正常組、模型組、大建中湯大、小劑量組，每組10只。

1.2 主要儀器、試劑及藥物 渦旋振蕩儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)、分光光度計(jì)(Therno scientific)、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；TRNzol總RNA提取試劑(天根生化科技(北京)有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa(寶生物))、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus), ROX plus(TaKaRa(寶生物))、引物合成(Invitrogen)；中藥材均購(gòu)自貴陽(yáng)同濟(jì)堂大藥店，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院方藥教研室汪毅教授鑒定為正品。造模用番瀉葉水浸液制備: 將番瀉葉按1∶1比例與水混合，于恒溫水浴箱中 (70oC浸泡24h將浸得液用3層紗布過(guò)濾后在4oC冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｖ委熡盟幋蠼ㄖ袦闹苽? 蜀椒( 炒去汗) ∶ 干姜∶人參∶飴糖( 烊化)=1∶2 ∶1 ∶5，分別制成a高劑量( 含生藥1.5g/mL)、b低劑量( 含生藥0.375g/mL) 兩種濃度水煎液。

1.3 模型制備及給藥 參照陳氏[1]文獻(xiàn)報(bào)道的綜合造模法改進(jìn)：將大鼠正常飼養(yǎng)3d，使之適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始造模。前5天，單日喂飼甘藍(lán)10g/200g，雙日喂飼精煉豬油2mL/200g，每日38oC溫水中游泳至疲勞。后6~21d，除以上因素外，加上每日灌番瀉葉水浸液2mL/200g。成功復(fù)制脾陽(yáng)虛模型。給藥方法：從第實(shí)驗(yàn)22d開(kāi)始給藥，正常組正常飼養(yǎng)；模型組灌服2mL/kg/d生理鹽水；大建中湯治療組：分大、小劑量組，分別灌服a、b水煎劑2mL/kg·d，以上各組灌胃均為15d。

1.4 標(biāo)本采集 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，次日將大鼠處死并立即取腦組織，置于-80e冰箱保存待用。

1.5 CaMKⅡmRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法，CaMKⅡ上游引物：5’-GAAGACCAAGTGGAGCCTGAC-3’，下游引物：5’-GGACCGAATCGACAAAGAAG-3’，產(chǎn)物大小：291 bp 。GAPDH 上游引物：5’-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3’，下游引物：5’-AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3’，產(chǎn)物大小：308 bp。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件20.0單因素方差分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1大鼠處于脾陽(yáng)虛疼痛后一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)倦怠、喜聚堆、腹瀉、皮毛枯槁易落、不能堅(jiān)持游泳、肛周污濁、抽搐等現(xiàn)象，表明造模成功。

2.2大建中湯對(duì)各組大鼠腦組織CaMKⅡmRNA含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組中CaMKⅡmRNA表達(dá)明顯升高，大建中湯高劑量組和低劑量組CaMKⅡmRNA表達(dá)與模型組相比明顯降低(P﹤0.01) ，提示大建中湯能降低脾陽(yáng)虛大鼠腦組織中CaMKⅡmRNA的表達(dá)。，見(jiàn)圖1、表1。

圖1　各組大鼠腦組織中CaMKⅡmRNA RT-PCR電泳圖

3討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)飲食失調(diào)傷脾胃、疲勞過(guò)度傷脾氣、苦寒瀉下傷脾陽(yáng)等綜合措施成功復(fù)制了脾陽(yáng)虛腹痛證模型。近年來(lái)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)及傳導(dǎo)傷害性刺激過(guò)程中，神經(jīng)系統(tǒng)的中樞敏化機(jī)制起到了非常重要的作用，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)所引起的傷害感受性受體敏化可能是慢性痛神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制之一，這越來(lái)越多的研究人員都已經(jīng)證實(shí)了這一結(jié)論并已形成了的共識(shí)[2-3]。而大建中湯作為治療脾陽(yáng)虛所致慢性腹痛的經(jīng)典方劑，我們推測(cè)大建中湯對(duì)這一過(guò)程亦有影響，為進(jìn)一步明確其鎮(zhèn)痛的分子機(jī)制，筆者將從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)信使CaMKⅡ進(jìn)行深入研究。大量報(bào)道證實(shí)，各種鈣調(diào)節(jié)傳導(dǎo)不同的信號(hào)過(guò)程是通過(guò)Ca2+濃度的改變完成的，其中鈣調(diào)素依賴蛋白激酶發(fā)揮的作用尤為重要[4]，它屬于Ca2+鈣調(diào)節(jié)素依賴蛋白激酶家族(Ca2+CaMK)中的一員。

表1　大建中湯對(duì)各組大鼠腦組織CaMKⅡmRNA含量的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P﹤0.01; 與模型組比較，﹟P﹤0.01;·P﹤0.01。

Ca2+鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的蛋白激酶2(calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是一種多功能絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，它大量分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中[5]，在腦中CaMKⅡ的含量也相對(duì)較高，約占全腦總蛋白的2%左右[6]。有研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ作為大腦中含量最高的蛋白激酶，在記憶和學(xué)習(xí)中，CaMKⅡ的自身磷酸化是記憶的一種分子機(jī)制，CaMKⅡ是其過(guò)程的分子基礎(chǔ)[7-8]。田徐露等[9]報(bào)道稱，具有特殊結(jié)構(gòu)和機(jī)制的CaMKⅡ，在急性、慢性疼痛所致的外周及中樞敏化過(guò)程中起著十分重要作用。張楠等[10]研究發(fā)現(xiàn)CaMKII在Ca2+敏感的急慢性疼痛信號(hào)通路中起到核心作用，它神經(jīng)可塑性改變基礎(chǔ)是不同外界刺激引起的。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白復(fù)合體的形成是由細(xì)胞內(nèi)Ca2+促進(jìn)而成的，從而激活CaMKⅡ并對(duì)AMPA(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸)受體的磷酸化。Ca2+/鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ-谷氨酸受體(Ca2+/CaM-CaMKⅡ-GluR)信號(hào)傳到通路是慢性疼痛的基礎(chǔ)條件。王慧等[11]的實(shí)驗(yàn)表明大建中湯對(duì)脾陽(yáng)虛大鼠腹痛治療作用療效可靠，本研究進(jìn)一步表明脾陽(yáng)虛癥能導(dǎo)致腦組織中CaMKⅡ的基因表達(dá)異常，大建中湯能顯著改善這種表達(dá)異常，下調(diào)CaMKⅡmRNA的表達(dá)，說(shuō)明大建中湯能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CaMKⅡ的作用。大建中湯具有散寒止痛、補(bǔ)虛緩急之功效，是治療虛寒引起腹痛的經(jīng)典方劑，治療脾陽(yáng)虛癥療效確切，通過(guò)本研究證實(shí)，在脾陽(yáng)虛癥腹痛時(shí)，腦組織中的CaMKⅡmRNA的表達(dá)異常，大建中湯能顯著對(duì)抗這種表達(dá)異常，這可能是其治療脾陽(yáng)虛癥作用環(huán)節(jié)之一。

參考文獻(xiàn)

[1]大建中湯對(duì)脾陽(yáng)虛大鼠TXB2及6-Keto-PGFa的影響[J].江蘇中醫(yī)藥，2003,24(2)：49.

[2]Fang L, Wu J, Lin Q, et al. Calcium-calmodulin-dependent protein kinase II contributes to spinal cord central sensitization [J]. J Neurosci 2002,22 (10): 4 196-4 204.

[3]Kawasaki Y, Kohno T, Zhuang ZY, et al. Ionotropic and metabotropic receptors, protein kinase A, protein kinase C, and Src contribute to C-fiber-induced ERK activation and cAMP response element-binding protein phosphorylation in dorsal horn neurons, leading to central sensitization[J]. J Neurosci 2004，24 (38): 8 310-8 321.

[4]PassierR,ZengH,FreyN,e tal.CaMkinasesignalinginducescar-diachpertrophyandactivatestheMEF2transcriptionfactorinvi-vo[J].J ClinInvest,2000,105(10):1395-1406.

[5]Soderling TR. CaM-kinases: modulators of synaptic plasticity[J].Curr Opin Neurobiol,2000,10(3):375-380.

[6]Lisman J,Schulman H,Cine H.The molecular basis of CaMKⅡ function in synaptic and behavioural memory[J].Nat Rev Neurosci,2002,3(3):175-190.

[7]孫臣友，胡偉。莪術(shù)油改善慢性低氧大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力[J]. 生理學(xué)報(bào)，2008，60(2)：228.

[8]Kelly MT,Crary JF,Sacktor TC.Regulation of protein kinase Mzatasythesis by multiple kinases in long-term potentiation[J].J Neurosci,2007,(27):34,39.

[9]田徐露，陳勝良，曹芝軍.CaMKⅡ參與內(nèi)臟痛覺(jué)調(diào)節(jié)的機(jī)制.胃腸病學(xué)，2011，16(4)：235-237.

[10]張楠，卜祥寧，方力，等. CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在慢性痛外周和中樞感受器中的作用[J].Chinese Journal of Clinical Anatomy，2008，26(3):344-346.

[11]王慧,武靜,陳繼婷，等. 脾陽(yáng)虛大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞OX42的表達(dá)及大建中湯的干預(yù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(2): 304-305.

收稿日期：(2015-02-10)編輯：王河寶

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

通信作者：武靜(1981—)，男，碩士，講師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。Tel：18286037064。

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目( QZYY2013-109)；貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目(貴中醫(yī)科院內(nèi)【2014】29號(hào))；貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(貴中醫(yī)大創(chuàng)合字【2014】45號(hào))。