固相萃取－超高效液相色譜法測定兵器工業生產廢水中14 種硝基酚類物質殘留濃度

劉玉，張同來，楊利，劉芮，劉影

(1.北京理工大學 機電學院，北京100081;2.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濰坊262500)

0 引言

隨著兵器工業的發展，多硝基多酚類點火藥因其優異的特點，已經被廣泛應用于點火藥的設計和生產中［1-3］。本文主要研究的三硝基苯酚(苦味酸PA)、三硝基間苯二酚(斯蒂酚酸TNR)和三硝基均苯三酚(TNPG)等硝基酚化合物(見圖1)，是一類具有全身毒性的化合物。硝基酚在被用作炸藥的同時，也被廣泛用于農藥、醫藥、染料以及橡膠工業生產中，這些物質能在自然環境中長期存在、積累和擴散，通過食物鏈對動植物的生存及人類的健康造成不良影響。目前，對廢水中硝基酚類有毒難降解有機物的控制是水污染防治中的重要課題之一［4-5］。

檢測環境介質中的硝基酚成為環境分析中的一個新研究熱點。目前，多硝基酚類物質的研究多集中在污染治理方面［6-9］，檢測方法局限于總量的檢測，多硝基酚污染物的分離、定性、定量檢測研究還存在著很大的缺陷［10］。同時其他硝基酚類的檢測方法主要有分光光度法［11］、微分脈沖伏安法［12-14］、氣相色譜法［15］、液相色譜法［16-17］、氣相色譜-質譜聯用法［18］等，這些相關的方法都只涉及部分硝基酚類，對于適合多硝基酚類特殊的強極性、熱不穩定等化學性質的定性、定量檢測方法研究較少。

本研究采用固相萃取(SPE)前處理方法，較其他前處理方法，如加速溶劑提取(ASE)［19-21］，微波輔 助 提 取(MAE)［22-24］和 超 聲 波 輔 助 提 取(USE)［25-27］等，具有選擇性強、溶劑使用量少、可對被測物富集等優點。通過對SPE 柱、液相色譜條件的選擇和優化，建立了SPE-超高效液相色譜法同時測定生產環境水樣中14 種硝基酚的簡單、快速且適合大批量樣品的定性、定量分析方法，并成功應用于生產環境水中實際樣品的分析，對調查我國生產環境水中硝基酚的污染現狀和環境控制具有重要意義，同時也為多硝基多酚類含能材料及其分解產物的分離和檢測提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AcquityTM 超高效液相色譜儀(UPLC)，配美國Waters 公司二極管陣列檢測器;美國Beckman 公司AllegraTM X-22R 型離心機;上海科導公司Sk8200LH 超聲波清洗器;Milli-QA10 超純水機;美國Agilent 公司32 位SPE 裝置;IKAMS3 漩渦混合器;美國Waters 公司0.45 μm 過濾膜。

14 種硝基酚類標準品見表1 所示。

SPE 柱(6 mL，0.5 g):Polymer SampliQ DVB、Bond Elut Plexa、Bond Elut C18、Bond Elut ENV(Agilent 公司產)，甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck 公司產)，甲酸、乙酸銨(分析純)，實驗用水為超純水。

實驗用空白環境廢水和化學合成區廢水均來自于某兵工廠生產廢水。

1.2 標準品制備

用乙腈將標準品配制成濃度為100 ～1 000 mg/L的單標標準儲備液，再將單標標準儲備液稀釋配制成不同基質、不同濃度的混標使用液。

1.3 樣品凈化

SPE 柱活化:依次用2.0 mL 甲醇、2.0 mL 水活化小柱。

上樣:控制流速1.5 mL/min，上樣5.0 mL 水樣。

淋洗:2.0 mL 水淋洗，并抽干1.5 min.

洗脫:3.0 mL 洗脫劑洗脫，洗脫液在溫度為45 ℃、水浴條件下，氮吹濃縮至0.5 mL，經0.45 μm濾膜過濾后待測。

1.4 超高效液相色譜分析條件

分析色譜柱:Accucore PFP 2.1 ×150 mm i.d.，2.6 μm;進樣體積:5 μL;流速:0.3 mL/min. 流動相為A:10 mM NH4AC +0.1%甲酸，B:乙腈。采用梯度洗脫:0 ～16 min，B 25% ～50%;16 ～22 min，B 50% ～60%;22 ～23 min，B 60% ～25%;23 ～25 min，B 25%.

其中，在流動相選擇上，考慮到14 種硝基酚標準溶液紫外最大吸收均在200 ～220 nm 左右，選擇測定波長為220 nm，這與甲醇的最大吸收波長非常接近。但是，如果用甲醇作流動相，會引起基線的漂移和波動，故流動相選擇在200 nm 附近處低吸收的乙腈體系。

為選擇合適的色譜柱，對色譜柱填料和被測物的結構、相互吸附性質進行研究，選擇全氟苯基色譜柱，在優化的流動相組成及pH 值和梯度洗脫等色譜條件下，如圖2 所示，14 種目標物標準品可獲得完全的基線分離。

圖2 14 種硝基酚標準品的液相色譜圖Fig.2 Liquid phase chromatogram of 14 nitrophenol products

2 固相萃取條件的優化

2.1 固相萃取柱的選擇

SPE 柱因其填料的不同可選擇的種類很多，具體實驗工作中，需根據分析對象、檢測手段及實驗室條件合理選擇合適填料、合理規格的SPE 柱。SPE柱的選擇要綜合考慮SPE 柱對分析對象的萃取能力、對雜質的吸附凈化效果、樣品溶液的體積及樣品溶液中被測物及干擾物的總量等。實驗選取4 種有針對性的SPE 小柱，具體種類見表2.

表2 4 種SPE 柱的特性Tab.2 Characteristics of 4 SPEs

實驗選取不含待測化合物的環境廢水樣品添加14 種硝基酚類標準品，濃度為5 mg/L，采用1.3 節的操作步驟，考慮到液相流動相的乙腈體系，暫以乙腈為洗脫劑，測得各目標物的回收率如圖3 所示，綜合考慮14 種硝基酚通過各SPE 小柱的回收率。結果顯示，14 種硝基酚通過Bond Elut Plexa 固相萃取小柱凈化后的回收率均在可接受范圍。

圖3 不同SPE 柱對回收率的影響Fig.3 Effects of different SPEs on recovery

2.2 固相萃取上樣量的選擇

實驗使用的Bond Elut Plexa SPE 小柱的填料量為0.5 g. 使用不含待測化合物的環境廢水樣品分別配制10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、40.0 mg/L 和50.0 mg/L 的添加標準品水樣，上樣5.0 mL，考察SPE 小柱的吸附容量，結果如圖4 所示。可見，質量濃度在10.0 ～30.0 mg/L 水平的樣品回收率在70%以上，而40.0 mg/L 加標水樣回收率開始降低，可見已經超出所用SPE 小柱填料的吸附負荷，因此對于濃度較高的樣品，分析前需要對樣品進行稀釋。

圖4 上樣量對固相萃取回收率的影響Fig.4 Effect of sample amount on SPE recovery

2.3 洗脫溶劑及其用量的選擇

選擇適合Bond Elut Plex SPE 柱使用的甲醇、乙腈、四氫呋喃作為洗脫劑，上樣為加標樣濃度為5. 0 mg/L 的空白環境水樣，考察不同洗脫劑的洗脫、回收率，實現樣品的最大回收。結果如圖5 所示，選擇洗脫劑回收率較高四氫呋喃作為洗脫劑。

圖5 洗脫劑對固相萃取回收率的影響Fig.5 Effect of eluent on SPE recovery

分別選擇1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 四氫呋喃對淋洗過的小柱進行洗脫，分別接洗脫液進行檢測，計算回收率，結果見圖6. 由圖6 可知，3 mL 四氫呋喃洗脫時，平均回收率較高，滿足回收率的要求，再增加洗脫劑體積，不但不會明顯改變洗脫效率，而且會導致萃取后樣品的稀釋，給后續濃縮、富集過程帶來不必要的麻煩。因此，本研究選用3 mL四氫呋喃作為SPE 的洗脫溶劑。洗脫液水浴45 ℃、氮吹濃縮至近干，乙腈定容1 mL，經0.45 μm 濾膜過濾后待測。

圖6 洗脫劑用量對固相萃取回收率的影響Fig.6 Effect of dosage of eluent on SPE recovery

2.4 樣品pH 值對固相萃取回收率的影響

環境廢水樣品，往往具有一定的酸堿度，所以有必要考察水樣pH 值對方法的影響。選擇加標濃度5.0 mg/L 的空白環境水樣，用甲酸和NaOH 溶液分別調節pH 值為2、3、5、7、9，以考察回收率。從圖7可見，pH 值在2 ～9 范圍內，隨著樣品的pH 值的降低，經SPE 處理回收率逐漸增高。綜合考慮SPE 柱的酸堿耐受性，選擇上樣前調節環境廢水樣品為pH值為2.

圖7 樣品pH 值對固相萃取回收率的影響Fig.7 Effect of pH on SPE recovery

綜合以上SPE 的最優條件，取空白環境廢水樣品添加5.0 mg/L 標準品，選擇Bond Elut Plexa SPE柱，四氫呋喃為洗脫劑，萃取、凈化、富集后進液相色譜檢測，色譜圖如圖8 所示，SPE 對環境廢水復雜基質樣品的萃取、凈化效果較好，基質效應對定量結果的影響較小，可以忽略，可以避免使用基質標準曲線，定量方法更快捷。

圖8 環境廢水中14 種硝基酚的液相色譜圖Fig.8 Chromatogram of 14 nitrophenol products in environmental waste water

3 結果與討論

3.1 方法的線性關系與檢出限

在優化的實驗條件下，以配制0.1 ～20.0 mg/L系列混合標準工作液。以各組分峰面積y 對濃度x(mg/L)繪制標準曲線，如表3 所示。結果表明，14 種硝基酚類在各自的線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數為0. 997 3 ～0. 998 7，可以滿足定量分析的要求。按3 倍信噪比計算環境廢水樣品中14 種硝基酚的檢出限LOD 為0.02 ～0.04 mg/L.

3.2 方法的準確度與精密度

分別在0.2、1.0、10.0 mg/L 水平下進行環境廢水樣品基質加標回收實驗，每個水平重復測定5 次，14 種硝基酚的平均回收率為82.5% ～104.8%，相對標準偏差3.2% ～5.7%，均符合痕量殘留檢測的要求，結果見表4 所示。

3.3 實際樣品測定

為了驗證方法的實用性，選擇采集某合成區域環境廢水樣品，采用本方法進行檢測分析，并添加0.3 mg/L 的14 種標準品進行加標回收驗證，結果見表5. 從表5 中可見化學合成區環境廢水樣品檢出有4-硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚和一定濃度的2，4，6-三硝基間苯二酚污染，同時各硝基酚加標回收均在80% ～110%之間，方法滿足實際應用要求。

表3 在環境廢水樣品基質中14 種硝基酚類線性方程、相關系數、檢出限Tab.3 Linear equations，correlation coefficients and LOD for 14 nitrophenol products in environmental waste water

表4 14 種硝基酚類在環境廢水樣品基質中添加回收率、精密度Tab.4 Recoveries and RSDs of 14 nitrophenol products in environmental waste water

4 結論

1)本文從SPE 柱選擇、上樣體積和樣品pH、洗脫劑選擇及用量等方面，確定了SPE 前處理方法在生產環境廢水中14 種硝基酚類物質的測定最優條件。利用本方法處理后的樣品，色譜圖雜質干擾少，基線平穩，可達到忽略基質效應影響的效果。

2)建立了生產環境廢水樣中14 種硝基酚類化合物的SPE-超高效液相色譜分析方法。14 種不同極性硝基酚類化合物在同一色譜條件下實現基線分離。平均加標回收率為82.5% ～104.8%;相對標準偏差在3.2% ～5.7%之間。由實際樣品的檢測結果可知，本方法具有簡便快捷、靈敏、準確等特點，可作為常規的檢測方法應用于生產環境水樣中痕量硝基酚類污染物的分析測試。

表5 某合成區域環境廢水樣品加標回收試驗Tab.5 Detecting results of 14 nitrophenol residues in production areas of Environmental waste water

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