堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

李 瑩，柳參奎

（1．東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心，黑龍江哈爾濱150040；2．黑龍江八一農墾大學寒地作物種質改良與栽培重點實驗室，黑龍江大慶163319）

堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

李 瑩1，2，柳參奎1*

（1．東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心，黑龍江哈爾濱150040；2．黑龍江八一農墾大學寒地作物種質改良與栽培重點實驗室，黑龍江大慶163319）

從堿茅酵母cDNA文庫中經過NaCl、Na HCO3篩選，均得到長為1153 bp堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因（Put TPS）片段。通過3′End cDNA amplification方法獲得基因缺失的3′序列，該基因全長3358 bp，編碼882個氨基酸。氨基酸序列比較結果表明，Put TPS氨基酸序列與水稻、擬南芥、玉米等多種高等植物的TPS蛋白的同源性高達60%～90%。利用Northern blot技術，研究該基因的組織表達模式及NaCl、Na HCO3脅迫處理下基因的表達模式變化；同時對轉p YES2-Put TPS基因酵母菌株進行鹽、堿、氧化脅迫、滲透脅迫處理，觀察其在逆境下的生存表現。結果表明，Put TPS具有組織表達特異性，其中在根和花中表達量最大；NaCl、Na HCO3會誘導Put TPS基因在根和葉中的上調表達；同時重組酵母菌株對鹽堿、氧化、滲透脅迫及干旱等逆境的適應能力顯著增強。以上研究結果表明，堿茅Put TPS基因與逆境之間具有一定的應答關系，并在植物適應環境逆境過程中起著重要的作用。

堿茅；6-磷酸海藻糖合成酶；基因表達；酵母

海藻糖是由兩個葡萄糖分子以ɑ，ɑ-1，1糖苷鍵連接的非還原性雙糖，廣泛存在于細菌、真菌、藻類、無脊椎動物和植物中［1］。它是植物在逆境脅迫條件下大量積累的一類物質，對植物抵御干旱、高溫、低溫、鹽、氧化脅迫及營養缺乏等逆境至關重要［2-6］。海藻糖在生物體中的合成途徑有5種，分布最廣的通路是TPS／TPP途徑，包括兩個步驟，兩個不同的酶。植物體內，途徑中，海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是海藻糖的合成過程中的關鍵作用酶，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在海藻糖-6-磷酸合成酶的催化作用下合成6-磷酸海藻糖（T6P），然后在海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）作用下生成海藻糖［7-9］。

1998年，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中一些與海藻糖生物合成相關的基因TPS和TPP被發現［10-11］。近期TPS和TPP的同源序列在水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）、陸地棉（Gossypium hirsutum）及卷葉柏（Selaginella lepidophylla）等多種植物中也被發現［12-16］。植物中的TPS基因都以基因家族的形式存在。已測序的物種中，擬南芥中發現了11個TPS基因，高粱（Sorghum vulgare）中發現了11個TPS基因，水稻中發現了11個TPS基因，蓖麻（Ricinus communis）中發現了13個TPS基因［17-20］。根據是否與酵母TPS1具有同源性，將TPS蛋白分成了兩個具有顯著區別的類群，只有酵母TPS1屬于Class I，同時TPS的活性已經被證實［19，21］。Class II TPS蛋白是否具有TPS活性還未被證實。

由于逆境下海藻糖對生物體的保護作用，目前研究表明，通過轉入海藻糖合成相關基因成功地改善了植物對逆境的抵御能力。OsTPS1過表達顯著提高了水稻幼苗對低溫，高鹽，干旱等逆境脅迫的耐受能力［22］。Sl TPS1基因可以有效地恢復酵母突變體tps1Δ對NaCl、Sorbital的敏感性，由此推斷Sl TPS1基因在卷柏的抗逆性方面發揮了重要作用［16］。過量表達擬南芥內源TPSI基因的植株耐旱性也得到了提高［23］。因此與海藻糖合成的相關酶在植物抗逆性方面發揮著重要的作用。

堿茅（Puccinellia tenuiflora）是一種禾本科單子葉鹽生植物，主要分布在我國的東北松嫩鹽堿草甸草原上。與其他鹽生植物相比，它在極端鹽惡劣的鹽堿環境下p H值9～10完成其整個生命周期［24］。它具有一套獨特的適應鹽堿逆境的生理機制，同時也具有潛在的實用價值。因此，它是一種理想的研究耐鹽機制的鹽生植物。

本研究利用3′End cDNA amplification方法，克隆得到具有完整ORF的Put TPS基因，并對該基因的組織表達模式以及在鹽、堿脅迫處理下的mRNA表達特性進行分析；同時深入分析過表達酵母對鹽、堿、滲透、氧化等脅迫的耐受能力。試圖探討鹽、堿逆境脅迫下該基因的抗性作用，為深入理解鹽生植物抗逆機理積累資料。

1 材料與方法

1．1 植物材料

堿茅植株及種子采自東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心安達野外實驗基地。2012年7月分離保存野外生長的堿茅根、莖、葉、花、果等部分組織。同時成熟的種子經20 mmol／L NaCl選種，選出籽粒飽滿的種子，5%NaClO3消毒5 min，無菌水洗3～5遍，25℃室溫水培養2周的堿茅幼苗為試材，相對濕度60%，光照6000 lx，光照時間為16 h／8 h。分別選取經500 mmol／L NaCl、40 mmol／L Na HCO3處理0，6，12，24，48 h后，分別收集葉部組織（地上部分）、根部組織（地下部分），液氮速凍后保存。并用于后期Northern blot分析。

1．2 基因的克隆與序列分析

堿茅cDNA文庫于2008年Ta KaRa公司合成構建于p GCAP10載體上，經過酶切、連接將其構建到改造的釀酒酵母表達載體p AUR101（Ta KaRa，Japan）上。利用LiAc／PEG酵母轉化法［25］，將其高效轉化到釀酒酵母菌株In VscI（Saccharomyces cerevisiae）中。通過對堿茅酵母文庫的耐鹽堿性篩選，從中均分離得到一抗性酵母克隆，通用引物PCR產物插入T載體測序得長度為1153 bp，測序后經比對分析發現，該片段為5′端的完整的堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因（Puccinellia tenuiflora trehalose-6-phosphate synthase，Put TPS）的部分序列。通過3′End c DNA amplification方法獲得基因缺失的3′序列［26］。所需引物如下：QT：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，QO：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′，QI：5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′，TPS-RACE1：5′-ATGACCTCTTCGAGGGCTTTCGG-3′，TPSRACE2：5′-ATGACCTCTTCGAGGGCTTTCGG-3′。

經比對拼接后，克隆全長序列。Put TPS基因全長克隆引物如下：TPS-F：5′-TTTCCTCGCCTTGGACTCGC-3′，TPS-R：5′-CTGGATGAGCCGCACGATGT-3′。ORF founder（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）程序確定其開放讀碼框。ProtParam（http：／／au．expasy．org／tools／protparam．html）軟件計算推導的蛋白質的分子量及理論等電點；利用http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM-2．0／對該基因的跨膜結構分析；利用Blast P（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／）進行序列同源性搜索；利用Clustal X 1．83軟件對具有同源性、不同植物來源的TPS蛋白序列進行多序列比對，并繪制分子進化樹。

1．3 m RNA表達特性分析

液氮速凍研磨收集的樣品，用TRIzol一步法提取總RNA，以10μg RNA在1．0%的甲醛瓊脂糖變性凝膠上電泳，并轉移到尼龍膜上。以DIG標記的Put TPS c DNA為探針進行雜交，并利用CDP-Star TM（Roche）來檢測Northern雜交信號［27］。

1．4 過表達Put TPS酵母菌株的抗逆性分析

分別取起始OD600約為0．6的p YES2-Put TPS和載體p YES2的10－1，10－2，10－3，10－4和10－5的酵母菌液于1．0和1．2 mol／L NaCl、14和25 mol／L Na HCO3、3．0 mol／L H2O2、1．8 mol／L Sorbital的半乳糖誘導的酵母培養基中，30℃培養3～5 d，調查其生長狀態。

2 結果與分析

2．1 Put TPS基因的克隆與序列分析

通過對堿茅酵母文庫的耐鹽堿性篩選，從中均分離得到一抗性酵母克隆，通用引物PCR產物插入T載體測序得長度為1153 bp的堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因片斷，測序后進行BLAST比對，發現具有該基因片段5′端的完整序列。該基因片段的堿基序列與紅豆杉（Festuca mairei，JN415683．1）、玉米（Zea mays，GU228588．1 76）的同源性分別為90%，76%。初步確認該基因片段為堿茅TPS基因序列的一部分（圖1）。根據這一段序列設計特異性引物TPS-RACE1、TPS-RACE2，分別與3′端通用引物QO、QI配對，擴增分離出長為2500 bp的端片段，測序比對后與中間片段序列一起拼接得到長3400 bp的Put TPS基因的cDNA全長序列，重新克隆基因并測序，Put TPS基因全長3358 bp。序列的ORF finder分析證實該基因的開放閱讀框（ORF）長2646 bp，推定編碼882個氨基酸，其中5′端非翻譯區包括612 bp，3′端非翻譯區包括100 bp，3359～3386位為Poly（A）尾（圖1）。BLASTP對Put TPS蛋白保守區的預測結果表明該蛋白屬于TPS蛋白（圖2）。GenBank中選取部分植物的TPS蛋白，經BLASTX分析發現堿茅TPS蛋白與水稻（Oryza sativa Japonica Group，AAN52740．1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，CAB10557．1）、玉米（Zea mays，ADA67991．1）、陸地棉（Gossypium hirsutum，AAV65494．1）、甜瓜（Cucumis melo subsp．melo，ADN34028．1）、紅豆杉（Festuca mairei，AEO13239．1）、銀杏（Ginkgo biloba，AAX16014．1）、丹參（Salvia miltiorrhiza，AEQ54916．1）、甘藍（Brassica oleracea，ABD 65165．1）、蓖麻（Ricinus communis，XP-002522255．1）等高等植物的TPS蛋白具有較高同源性，同源性高達60%～90%（圖3）。軟件Clustalw1．8．1對此種蛋白相近的10個物種的TPS蛋白序列進行聚類分析，結果表明，堿茅中克隆的TPS蛋白與羊草（Leymus chinensis）的TPS蛋白親緣關系最近，與黃瓜、蓖麻中發現的TPS蛋白親緣關系較遠（圖4）。

ProtParam預測該基因編碼蛋白質的分子量為100．37 k Da，理論等電點（pI）為9．25，為堿性蛋白。負電荷氨基酸（Asp＋Glu）總數為95，正電荷氨基酸（Arg＋Lys）總數為119。不穩定系數為56．06，為穩定的蛋白質。據TMHMM v．2預測，信號肽預測表明該基因編碼的蛋白無信號肽結構。Put TPS編碼的蛋白為一種非跨膜蛋白，這一特性與其他植物中發現的TPS蛋白相一致。

2．2 Put TPS基因在堿茅不同組織中的表達

利用Northern blot技術，對Put TPS基因在野外生存堿茅的根、莖、葉、花、種子中的表達模式進行分析。結果表明，Put TPS基因在莖中未見表達，在根、葉、花、種子中均有表達，其中在根和花中表達水平最高，表明Put TPS基因具有組織表達特異性（圖5）。

2．3 鹽、堿逆境脅迫下Put TPS基因的m RNA水平表達特性

為了研究Put TPS基因與鹽、堿脅迫的應答相關性，利用Northern blot技術分析其m RNA在鹽、堿脅迫下地上組織和地下組織表達特性的變化（圖6）。在NaCl脅迫處理下，該基因在葉部的表達量隨著處理時間的延長而增加，當12 h時表達量達到最大。在根部，隨著鹽處理時間的改變，基因的表達量先降低，但12 h時表達量迅速升高，達到最大，隨后逐漸降低。在Na HCO3脅迫處理下，該基因在葉部的表達量在6 h時已達到最大，根部在12 h時表達量達到最大。綜上所述，在NaCl、Na HCO3處理下Put TPS基因無論在根部，還是葉部，都主要表現為上調表達。這表明Put-TPS基因有可能參與了堿茅的耐鹽、堿應答反應，屬于鹽、堿逆境脅迫的相關基因。

2．4 p YES2-Put TPS在酵母中的表達及其抗逆性

酵母是單細胞真核生物并與植物有著類似的代謝途徑，遺傳操作簡單易行，是外源蛋白表達的合適宿主，p YES2是半乳糖誘導的過表達載體。因此，本研究利用酵母表達體系開展了轉基因酵母對逆境的耐性實驗。對含有p YES2-Put TPS和p YES2的酵母菌（陰性對照）逆境處理的抗性檢測發現（圖7），正常情況下，含p YES2-Put TPS和p YES2的酵母菌在無逆境處理的YPD培養基上生長情況相似；但在1 mol／L NaCl脅迫下轉p YES2-Put TPS酵母長勢略優于對照菌株；隨著NaCl濃度的增加，抗性生長優勢力成為明顯，當濃度達到1．2 mol／L時，對照菌株無法正常生長，但轉p YES2-Put TPS酵母菌株仍可正常生長。說明過表達Put TPS提高了酵母菌株對鹽脅迫的耐性存活能力。在堿逆境（14和25 mmol／L Na HCO3）、氧化逆境（3．0 mmol／L H2O2）、滲透脅迫（1．8 mol／L Sorbital）等逆境下，轉p YES2-Put TPS酵母菌的長勢均明顯優于轉對照菌株，這些結果均說明Put TPS在酵母中過量表達能夠提高其對堿、氧化、滲透逆境的耐性。綜上所述，Put TPS基因的過量表達對酵母在環境脅迫中的生長發揮重要作用。

3 討論

我國因土地鹽堿化、荒漠化，造成劣質土地已成為制約區域可持續發展及綠化生態環境的核心因素。在長期進化過程中形成了形形色色的植物，包括有著微妙的適應環境的生長發育調節機制，不同的物種針對相應環境因子的調控作用卻有著時空差異的分子基礎［28-30］。

分子選育是抗鹽堿植物新品種的關鍵，就是從鹽生植物里分離抗鹽堿功能基因。堿茅不僅是一種優良的牧草，還是一種寶貴的鹽生種質資源，堿茅可在p H 10以上的堿斑地上正常生長發育，目前它被人們稱作極端耐鹽堿先鋒植物，種植堿茅不但對鹽堿土壤具有改良作用，同時為相關研究提供了豐富的耐鹽堿基因資源。這不僅有助于培育耐鹽堿轉基因農作物、牧草和花卉，而且還為我國鹽堿草甸草原的改良和綜合治理提供理論基礎，具有重大的經濟價值和生態效應。

當植物遭遇干旱、鹽堿、低溫等逆境時，就會在體內積累各種小分子物質，提高細胞液濃度，降低其滲透勢，并保持一定的壓力勢，來維持細胞的正常膨壓。參與滲透調節的物質有很多，大致可分為兩大類。一類是由外界進入細胞的無機離子，一類是在細胞內合成的有機物質，如脯氨酸、甜菜堿、甘露醇和海藻糖等。研究表明，海藻糖是一種典型的應激代謝產物；當生物體生長環境良好時，體內不積累海藻糖；而當生物體處于脅迫環境（如饑餓、干燥、高溫和高鹽堿等）時，體內就會迅速積累海藻糖，海藻糖的積累提高了對生物體內蛋白質、酶與細胞膜等活性物質的保護，而且這些海藻糖會隨著不良環境的解除而被降解［30-31］。

植物TPS基因，是海藻糖合成過程中的關鍵基因，TPS外源基因的導入，即可合成6-磷酸海藻糖。而6-磷酸海藻糖脫磷酸轉化為海藻糖，可由細胞內廣泛存在的非特異性磷酸酯酶催化完成，所以TPS酶對海藻糖的積累至關重要［10，16］。本研究過表達Put TPS的酵母對鹽、堿、氧化及滲透脅迫等多重逆境生長存活能力均有提高，推定過表達Put TPS基因有助于堿茅體內海藻糖合成增加，它的積累提高堿茅對各種逆境脅迫抵御。2003年Jang等［32］在研究轉基因水稻Ubi 1：：TPSP（轉入TPS和TPP具有雙融合功能基因的轉基因水稻）時發現，在逆境脅迫下，轉Ubi 1：：TPSP基因水稻由于植株體內海藻糖的大量積累，提高了轉基因植株對干旱、鹽、低溫的耐受性。我們的m RNA轉錄研究表明Put TPS受逆境脅迫誘導，這可能也與逆境脅迫下植株體內海藻糖合成需要大量的酶積累有至關重要的關系。該基因是在極端耐鹽堿植物堿茅中分離得到，這也進一步為解釋堿茅為何能更好地適應極端惡劣條件的研究奠定了一定的基礎。以后研究可以考慮在轉基因植物上研究該基因的特性，以期揭示Put TPS基因提高生物抗逆性的機理。這將為深入了解該基因家族的功能提供新的資料，同時也為進一步研究鹽生植物的抗鹽分子機制鑒定基礎，對植物抗逆分子育種工作具有一定的理論指導意義。

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Cloning of a TPS gene and analysis of its function in stress tolerance in Puccinellia tenuiflora

LI Ying1，2，LIU Shenkui1*
1.Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Key Laboratory of Crop Germplasm Improvement and Cultivation in Cold Regions，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China

In this study，a 6-trehalose phosphate synthase gene（TPS）fragment，1153 bp in length，was isolated through NaCl and Na HCO3screening from Puccinellia tenuiflora yeast cDNA library．A 3′-end cDNA amplification technique was used to clone Put TPS．The full-length c DNA is 3358 bp containing an open reading frame（ORF）of 882 amino acids．Multiple alignment analysis based on amino acids of TPS proteins of rice，Arabidopsis，maize，and other higher plants revealed that the amino acid homologies were about 60%to 90%．The tissue expression patterns of P.tenuiflora Put TPS and the expression under NaCl and Na HCO3stress were further investigated by northern blot．Also the recombinant yeast INVScI（p YES2-Put TPS）and control INVScI（p YES2）were subjected to salt，drought，osmotic and oxidative stresses．Put TPS was highly expressed in roots and flowers；in roots and leaves，NaCl and Na HCO3induced up-regulated expression of Put-TPS genes and the recombinant yeast cells showed higher stress resistance than control cells．It was also found that the TPS from alkali grass contributes to salt，drought，osmotic and oxidative resistance．The present study indicated that there was a relationship between Put TPS expression and multiple stresses，and Put TPS may play an important role for P.tenuiflora during adaption to environmental abiotic stress．

Puccinellia tenuiflora；6-trehalose phosphate synthase；gene expression；yeast

10．11686／cyxb20150113 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

李瑩，柳參奎．堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析．草業學報，2015，24（1）：99-106．

Li Y，Liu S K．Cloning of a TPS gene and analysis of its function in stress tolerance in Puccinellia tenuiflora．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：99-106．

2013-12-13；改回日期：2014-01-15

黑龍江省寒地作物種質改良與栽培重點實驗開放課題資助項目（CGIC201204），教育部創新團隊發展計劃（IRT13053），黑龍江省自然科學基金項目（C201406），中央高校基本科研業務費專項資金（2572014BA20），863項目（2013AA102701-7）和哈爾濱市自然科學基金（2008RFQXN007）資助。

李瑩（1979-），女，黑龍江哈爾濱人，講師，博士。E-mail：LY7966＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：shenkuiliu＠nefu．edu．cn