人巨細胞病毒感染的實驗室診斷技術研究進展

唐華

（第三軍醫大學大坪醫院VIP體檢中心，重慶400042）

人巨細胞病毒感染的實驗室診斷技術研究進展

唐華

（第三軍醫大學大坪醫院VIP體檢中心，重慶400042）

巨細胞病毒/免疫學；巨細胞病毒感染/診斷；抗原，病毒/分析；綜述

最近研究結果顯示，人巨細胞病毒（HCMV）的感染率在人群當中非常高，流行病學研究數據顯示我國為HCMV高發地區，尤其是在經濟發展相對滯后地區尤為嚴重[1]。通過密切接觸感染者的體液（尤其是尿液、唾液、血液和生殖器分泌物）在人群中傳播[2]，HCMV侵入機體后，將長期或終身存在于人體內。對于絕大多數免疫功能正常的個體來說，常表現為沒有臨床癥狀的潛伏感染。對于孕期婦女和兒童，HCMV感染的臨床癥狀較為嚴重，產前合并HCMV急性感染易導致胎兒流產、早產以及畸形發生率增高[3]。在嬰兒出生后3～4周內從嬰兒的尿液或唾液中分離出HCMV，是診斷為先天性HCMV感染的“金標準”[4]。對于免疫功能低下者，如器官移植后、骨髓移植后、免疫缺陷患者和采用免疫抑制劑治療的患者，HCMV的感染是引起其高致死率的重要原因之一。對于造血干細胞移植者，巨細胞病毒感染是術后3個月內最主要的并發癥及死亡原因[5]。另有研究表明，HCMV感染與人類動脈粥樣硬化以及冠狀動脈心臟病的發生也有重要關系[6-7]。目前針對HCMV感染的實驗室檢查主要集中于器官移植受者、孕婦、新生兒等人群。因此，如何準確、快速和特異性地監測HCMV活動性感染，以指導臨床治療成為了學者研究的關鍵。

1 HCMV的生物學特點

HCMV是人類皰疹病毒5型（HHV-5），屬于皰疹病毒科β亞科，為球形。核衣殼是由162個殼微粒組成的立體對稱20面體，雙鏈線性DNA組成了核衣殼內部的病毒基因組核心，而HCMV的核衣殼包含了超過25種病毒編碼的蛋白質[8]。HCMV自我復制的周期分為以下3個階段：即早期、早期和晚期，與之相對應的基因分別為α、β和γ，其表達的產物分別稱為即刻早期抗原（IEA）、早期抗原（EA）和晚期抗原。

2 HCMV的檢測方法

2.1 病毒培養診斷HCMV感染的“金標準”是體液中分離出巨細胞病毒。研究顯示內皮細胞、上皮細胞和人胚肺成纖維細胞是HCMV感染的主要對象[9-10]。而分離的傳統方法則是將樣本中的病毒接種到例如人胚肺成纖維細胞的敏感細胞中。HCMV感染人胚肺成纖維細胞后一般需要1～3周的時間才會出現典型的細胞病變，陽性結果需要進行免疫學方面的鑒定。而判斷為HCMV病毒分離陰性的診斷結果至少需要4周以上的時間，必要時還要進行宣傳。由于HCMV增殖速度緩慢，傳統的病毒分離方法已達不到早期快速檢測HCMV的目的。而改良后的細胞快速培養技術利用了HCMV即刻早期蛋白IE72的單克隆抗體進行免疫熒光實驗或酶聯免疫實驗，來檢測細胞中病毒表達的即刻早期蛋白。Alexander等[11]建立了一種新的微量病毒檢測技術，即將免疫熒光技術與快速組織培養相結合，先在96孔板中培養人胚肺成纖維細胞，然后向孔中加入處理過的單克隆抗體，接種后3 d就可以檢測結果。該方法節約了確診時間，方便、易行，適合大批量臨床標本的檢測。

2.2 病毒抗原的檢測人體感染HCMV后，即可在外周血白細胞中檢測到HCMV抗原。以往使用熒光標記抗體通過免疫組化技術來檢測抗原的方法不但耗費時間長而且操作復雜。近年來開展的HCMV抗原血癥實驗，即檢測外周血單個核細胞中的HCMV抗原，用于診斷早期活動性HCMV感染。該實驗診斷急性HCMV感染的敏感性和特異性均大于90%，而對于有癥狀的HCMV感染其敏感性為100%。目前主要檢測的是HCMV膜蛋白pUL83（pp65）。它是HCMV感染早期就出現的敏感性標記抗原，其肽序列具有高度的保守性，數量占病毒總蛋白數量的15%。pp65在HCMV活動性感染后2～24 h內就可在血液白細胞當中表達，比病毒核酸出現在血漿中的時間更早，并且在病毒活動期間持續表達[12-13]。患者接受治療后該蛋白隨病毒消失而消失，且蛋白表達量與病毒載體量呈正相關。目前可以用免疫組織化學和流式細胞術對pp65作定性和定量的分析。阮光萍等[14]采用流式的方法對pp65進行了檢測，整個操作過程只需要2 h，并且能夠定量檢測pp65抗原陽性細胞。當免疫抑制劑和抗病毒藥物等因素影響了白細胞的數量和功能時，則會影響pp65抗原的檢測，所以HCMV pp65抗原血癥檢測可能不適用于血液移植患者。

2.3 血清學檢測

2.3.1 HCMV特異性抗體的檢測通過檢測血清中的抗HCMV-IgG和IgM來間接檢測HCMV的感染情況。如果IgG陽性則說明過去感染過HCMV，而血清轉化或連續監測IgG滴度連續升高表明有HCMV活動性感染。在HCMV感染后的1～3個月內血清IgM會維持在一個比較高的水平，所以IgM陽性標志著病毒處于活動期。但是HCMV潛伏感染率高，因免疫抑制而使HCMV被激活引起復發感染時，IgM不一定出現；且移植后免疫功能被免疫抑制劑等藥物所抑制，抗體經常延遲產生或短缺，故有HCMV活動性感染時，HCMV IgM檢測不一定呈陽性。在臨床上常將IgM的檢測結果作為判斷HCMV近期感染或者活動性感染的依據，將IgG抗體作為HCMV既往感染的指標[15]。如果抗HCMV IgM抗體陽性的同時伴抗HCMV IgG抗體陰性，則表明是HCMV原發性感染。目前用于檢測HCMV抗體的方法有放射免疫法、熒光免疫法和ELISA。運用傳統的ELISA方法檢測HCMV抗體，結果容易被類風濕因子、自身抗體或EB病毒等產生的交叉反應所干擾，造成假陽性結果[16]。目前抗體捕獲ELISA應用較多，該方法具有較高的靈敏度和特異性，避免了以上干擾因素，有利于結果的分析、判斷[17]。吳福清[18]比較了ELISA和RT-PCR對產前篩查女性巨細胞病毒IgM抗體水平檢測的敏感性及特異性，發現后者的敏感性和特異性更高。

2.3.2 抗體親和力檢測對于免疫抑制者，相對于繼發感染，原發感染往往伴有明顯的臨床癥狀；對于孕婦，孕期中發生的原發感染對胎兒的影響比繼發感染更嚴重。但是檢測特異性抗體只能區分有無HCMV感染，而不能區分原發感染、再感染和潛伏-激活感染。研究發現HCMV感染者體內IgG抗體親和力水平在接觸抗原后逐漸升高，因此，IgG抗體親和力水平可以區別是由于近期病毒感染產生還是既往感染遺留。通過聯合檢測HCMV特異性IgM抗體和IgG抗體的親和力，即以檢測血清IgM抗體作為初篩，然后對IgM抗體陽性的標本進行IgG抗體親和力指數的測定，可明確是否發生原發感染[19]。

2.4 HCMV核酸的檢測在體液中，HCMV感染后病毒核酸比血清學證據和臨床癥狀出現得更早，因此可將檢測HCMV核酸作為HCMV感染的早期診斷指標。HCMV核酸檢測的對象主要為DNA和基因轉錄產物mRNA。HCMV核酸的檢測用于HCMV感染的診斷有其獨特的優點：既能夠檢測到未與細胞結合的病毒又可以檢測不同的標本，如外周血白細胞、血漿、組織、支氣管灌洗液和尿液等；即使延遲處理的標本對檢測結果的特異性和敏感性也無明顯的影響。

2.4.1 DNA的檢測PCR在HCMV感染的實驗室診斷中發揮了重要的作用，該技術包括巢式PCR、RT-PCR、捕獲探針ELISA-PCR和實時熒光定量PCR（FQ-PCR）等[20]。FQ-PCR技術的問世填補了普通PCR在HCMV潛伏再激活中的研究，大量研究資料證明HCMV DNA的量變與疾病的進展明顯相關[21]。FQ-PCR是在PCR的基礎上進一步發展起來的高靈敏度核酸定量檢測技術。在PCR循環中測量的信號作為熒光閾值（threshold）的坐標，并引入了Ct值（cycle threshold）這個概念。Ct值是指熒光信號被檢測到時所需的最小循環數，即在PCR循環中熒光信號由本底進入指數增長階段這個拐點所對應的循環次數。FQ-PCR的方法有多種，包括SYBR Green、分子信標、FRET探針、Lightcycle技術和Complex探針技術等。大量研究表明，在HCMV病毒感染后1 h就可檢出HCMV的IE基因[22]。朱雪嬌等[23]使用FQ-PCR檢測了50例臨床乳汁標本的HCMV IE基因，結果發現整個體系特異性為100%，重復性較好，Ct值變異系數小于5%，整個實驗用時也較短，僅需90 min就可一次性完成大批量檢測，與臨床常用的ELISA方法相比，耗時大大縮短了，操作簡單、方便。

2.4.2 mRNA的檢測應用PCR檢測HCMV DNA時，擴增后產生的大量產物非常容易造成實驗室的環境污染，導致假陽性結果。雖然PCR結果陰性對HCMV感染的排除率高[24]，但PCR結果陽性只能證明存在病毒，不能判斷病毒是處于活動感染還是潛伏狀態，因此要明確診斷需進一步檢測RNA。HCMV mRNA的存在是病毒復制與否的標志，通過檢測HCMV mRNA可以早期診斷出HCMV活動性感染。將RNA模版的反轉錄與cDNA的PCR相結合用于檢測mRNA可以早期診斷HCMV活動性感染，評價體內病毒復制的狀況。另一種檢測HCMV mRNA的方法是核酸基礎序列擴增技術（NASBA），它是利用硅石依賴的核酸提取術，在恒溫條件下直接擴增RNA而不需預先對DNA進行切割和擴增。NASBA整個擴增反應僅由3種酶控制，反應不需要特殊儀器，易實現自動化；而且反應不需要高溫變性步驟，不會受到外來雙鏈DNA的污染；可避免常規檢測和分析RNA的標準方法中需要大量RNA；反應快、敏感性高、重復性良好[25]。

2.5 生物芯片技術生物芯片是基于微加工技術和微電子技術的微型生化反應平臺，不僅用于病毒的抗原和抗體以及核酸的定性和定量檢測，還可用于對病毒變異和多種病毒的同步分析。生物芯片可分為4種類型，包括基因芯片（gene chip）、蛋白質芯片（protein chip）、芯片實驗室（lab chip）和“大芯片”技術。

2.5.1 基因芯片即在玻片或硅片等支持物上有序而高密度的固定排列了大量靶基因片段或寡聚核苷酸片段（分子探針），將熒光標記樣本核酸分子后與固定在支持物上的DNA陣列（DNA micro-array）中的探針進行雜交。通過激光共聚焦顯微鏡激發和檢測雜交后的熒光信號強度，計算和分析樣品分子的數量和序列信息，從而可以對基因序列和功能進行大規模，高通量的研究。近年來的研究顯示，該技術在病原體檢測方面具有較高的特異性和敏感性[26-27]。

2.5.2 蛋白質芯片在生物芯片中，如果點的樣品是蛋白質（抗原、抗體或多肽），檢測的對象也是蛋白質時，這種芯片稱為蛋白質芯片。

2.5.3 芯片實驗室即在一塊或若干塊芯片上完成對蛋白質或核酸的提取、雜交，PCR及電泳等一系列分子生物學操作。芯片實驗室使對核酸和蛋白質的檢測更加方便、快速和靈敏。

2.5.4 “大芯片”技術以共用探針為基礎，同時檢測多基因/位點的PCR技術。將被檢測的基因或位點的特異性引物置于微孔板上，其設計原理類似基因芯片。

生物芯片的主要優點是：（1）分析過程實現了高度自動化和集成化，大大提高了分析速度；（2）降低了樣品和試劑的用量；（3）能夠同時處理數個樣本；（4）防止污染，有效排除了外界因素對結果的影響。但是目前生物芯片技術的成本過高，僅限于實驗室對HCMV的研究工作。

3 小結

HCMV與器官移植受者感染，孕婦的產前診斷和新生兒早期診斷之間有著十分緊密的關系，所以對HCMV檢測的研究就顯得日益重要起來。多數情況下HCMV感染都屬于亞臨床感染，沒有典型的臨床癥狀，給診斷帶來了較大的困難。目前對HCMV的檢測多依賴于實驗室檢測。由于HCMV病毒培養的時間太長，已不適用于臨床應用。而免疫抑制劑的使用和“窗口期”的問題使血清學檢測缺乏敏感性，在需要區分病毒原發感染和繼發感染時并不是理想的檢測方法，現多用于患者免疫狀態的評估和孕婦的篩查。抗原血癥和核酸的檢測可反映病毒的活動狀態，敏感性和特異性都較高，適合早期診斷HCMV活動性感染。現在針對住院患者多采用抗原血癥或者PCR來檢測HCMV，同時采用抗原血癥檢測來對患者進行隨訪[28-29]。但是HCMV的pp65抗原存在于白細胞中，標本必須在8 h內進行處理，否則檢測的敏感性會大大降低；并且在病毒拷貝數低的情況下，可能檢測不出pp65抗原[30]。有研究指出，相比于pp65抗原血癥分析，用實時PCR技術檢測HCMV感染具有更高的敏感性，但對于活動性感染的檢測又不如抗原血癥分析敏感[31]。目前也有將HCMV DNA的檢測與mRNA及血清IgM檢測相結合作為對妊娠HCMV感染與垂直傳播的評價手段[32]。生物芯片技術是一種新興的診斷技術，還存在如假陽性率偏高和需要先對檢測標本進行聚合酶鏈反應擴增等缺點，而且檢測成本太高，目前還不適合于臨床應用。隨著研究的深入，更敏感、快速、特異且易標準化的實驗室檢測技術將在HCMV感染的診斷和治療中起到更大的作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.024

A

1009-5519（2015）03-0383-04

2014-04-18

2014-09-19）

唐華（1979-），女，重慶萬州人，護師，主要從事醫院體檢方面工作；E-mail：462632936@qq.com。