溶髓方干預大鼠頸椎動力平衡失調(diào)后椎間盤髓核細胞體的體視學研究*

溶髓方干預大鼠頸椎動力平衡失調(diào)后椎間盤髓核細胞體的體視學研究*

★章友財1*第一作者：章友財(1973—)，男，學士，主治醫(yī)師。研究方向：四肢及脊柱相關疾病。劉金浪1,2(1.永修縣中醫(yī)院江西 永修 330300；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院研究生南寧 530001)

摘要：目的：觀察全國名老中醫(yī)經(jīng)驗方溶髓方對大鼠頸椎動力平衡失調(diào)模型中椎間盤髓核組織超微結構的影響，探索研究溶髓方防治頸椎間盤退行性病變的作用機制。方法：選取健康wistar大白鼠36只，隨機分為空白組、對照組和實驗組各12只。實驗組和對照組建立wista大鼠動靜力失衡性頸椎間盤退變模型;空白組為假手術組，僅切開頸椎后緣皮膚后即縫合。造模后2周開始灌胃，實驗組給溶髓方湯劑，對照組和空白組分別給生理鹽水，每日1次，持續(xù)喂藥1個月，分別于造模后第9周、第18周、第36周處死三組大鼠，并取下頸椎第4/5、5/6椎間盤。行椎間盤髓核HE染色，并從組織超微結構線粒體層面，透射電鏡觀察來評定溶髓方干預本病的療效。結果：造模期滿后，透射電鏡下大鼠椎間盤細胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)退變細胞，核膜皺縮，細胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象。給藥后，實驗組細胞質(zhì)內(nèi)線粒體結構大部分可見完整的結構，嵴結構清晰，腫脹消失，其基質(zhì)呈深暗色，數(shù)量增加。而對照組線粒體無明顯恢復，細胞則繼續(xù)呈現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。再從線粒體體視學層面上觀察分析，藥物干預后的實驗組、對照組的線粒體體密度接近空白組，兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而實驗組的線粒體數(shù)密度、比表面積、比膜面積數(shù)值都較對照組有明顯增大，有可比性(P<0.05)，上述表現(xiàn)隨著時間推移更加明顯。結論：大鼠頸椎間盤退行性病變初期，予溶髓方口服治療，從超微結構線粒體水平上觀察，其細胞恢復效果較顯著，基本證實溶髓方能防治早期頸椎間盤退行性病變。

關鍵詞：椎間盤退變；頸椎；動力平衡失調(diào)；線粒體；體視學

頸椎間盤的退行性病變是導致頸椎病的病理學基礎，椎間盤髓核組織在退變中會較早發(fā)生組織形態(tài)學改變，因此，通過研究椎間盤髓核組織的退變這一始動因素，揭示髓核的超微結構變化，從而認識其退變過程，鑒于中藥方劑在干預椎間盤退變動物模型中對髓核組織超微結構的研究較少，本研究選用已在臨床上具有較好效果的全國名老中醫(yī)方劑經(jīng)驗方溶髓方作為干預藥物，通過動物造模實驗對頸椎間盤的超微結構及線粒體的觀察，對其療效機制層面做進一步研究。現(xiàn)報道如下。

1材料

1.1　動物

本實驗選擇6月齡wistar大鼠，雌雄各半，體重90～120g。廣西醫(yī)科大學實驗動物中心對本研究提供實驗動物，動物合格證號(SCXK桂2003-0003)。實驗過程中對動物的處置參照科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。

1.2　試藥

溶髓方：當歸15g,白芍15g,赤芍12g,乳香9g,沒藥9g,田七9g,雞血藤20g,秦艽12g,五加皮12g,川續(xù)斷12g,牛膝10g,延胡索12g。蘇木色精、伊紅(水溶性)(上海國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3　儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進公司)；全自動石蠟切片機(德國美康公司)；H-7650型透射電子顯微鏡(HITACHI)。

2方法

2.1　動物模型的建立

2.1.1動物分組將36只健康的wistar大鼠隨機分成3組：空白組、對照組、實驗組，每組12只，雌雄分開喂養(yǎng)。亞組分組：按照處死時間每組再隨機分3個亞組，分別是9周、18周、36周，4只樣本每個亞組，隨機編號并記錄。

2.1.2建立動物模型空白組行假手術，僅切開頸椎后緣皮膚后縫合。對實驗組及對照組行實驗造模，造模采用wista大鼠頸椎動力平衡失調(diào)椎間盤退變模型，頸椎的兩柱或三柱結構破壞(動靜力平衡失調(diào)，Static nonequilibrium)可引起或加速椎間盤退變已被大量研究證實[1-2]，本實驗使用3%的戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉,術前定位后，行手術區(qū)域常規(guī)碘伏消毒。沿頸背部棘突做后正中切口,切開皮膚后,沿棘突兩側切斷椎旁肌，分離附著于椎板、棘突及小關節(jié)的肌肉，暴露棘突、椎板和關節(jié)突,使用椎板鉗依次去除頸3～7的棘上韌帶、棘間韌帶及兩側關節(jié)突的后外1/2,切斷雙側豎棘肌，誘發(fā)脊柱及椎間盤加速退變，然后依次縫合各層組織，關閉手術切口，術畢，最后給予術后大鼠肌注一次青霉素抗感染治療。

2.2　給藥方法

實驗組予以溶髓方煎至湯劑后灌胃，所用生藥劑量按照人與動物千克體重換算，溶髓方用生藥0.74 g/(kg·d)，相當于臨床60kg體重人的等效劑量，于造模2周后灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃1個月。空白組和對照組予以等容量生理鹽水灌胃。

2.3　觀察項目及方法

分別在術后第9周、第18周、第36周以大劑量腹腔注射戊巴比妥溶液處死各組大鼠。使用手術顯微鏡下切取頸椎第4、5椎間盤(C4/5)髓核組織，將所取得的椎間盤髓核組織做成病理切片，進行椎間盤HE染色，使用HE染色觀察椎間盤細胞形態(tài)，從而評估腰椎間盤髓核細胞凋亡狀況。同時在手術顯微鏡下切取頸椎第5、6椎間盤(C5～6)髓核組織，制備超微結構透射電鏡切片，將各組制作好的切片，采用H-7650型透射電子顯微鏡觀察骨組織內(nèi)超微結構線粒體在形狀、數(shù)目、結構等層面的具體變化情況。

2.3.1HE染色法將所取各組C4/5髓核標本標本用4%多聚甲醛固定24h后取出后，梯度酒精脫水，無水酒精與二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，將包埋后的組織塊在切片機上連續(xù)切片，厚度為4um。經(jīng)蘇木精及伊紅液染色5～10min，中性樹膠封片，各組取6張×40倍椎間盤切片HE染色照片，觀察椎間盤髓核組織各切片組織形態(tài)學改變。

2.3.2超微結構透射電鏡切片制備將所取各組C5/6髓核標本投入2%戊二醛溶液中固定48 h(4℃條件下)；經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS液，pH 7.0)漂洗3次，每次15 min；2%鋨酸固定2 h，經(jīng)PBS液漂洗3次，每次15 min；乙醇逐級脫水：50%→70%→80%→90%→100%→100%，至丙酮，每次20 min；樣品用Epon 812包埋，包埋塊經(jīng)瑞典LKB-V超薄切片機切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色各15min。

圖1　椎間盤髓核HE染色(×40)

3實驗結果

3.1　各組頸椎間盤髓核組織HE染色結果

造模第9周后，實驗組與對照組椎間盤髓核組織中可見大量炎性細胞浸潤并伴有新鮮肉芽組織及新生血管的形成，而空白組椎間盤髓核組織在9、18周未出現(xiàn)明顯退變，僅在36周是組織邊緣出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤。隨著實驗時間的延長，實驗組與對照組髓核組織退變呈現(xiàn)進行性加重，其中以對照組更加明顯，溶髓方對大鼠椎間盤髓核組織有明顯的干預作用，主要表現(xiàn)為減少細胞凋亡、抑制炎性細胞浸潤從而減緩髓核組織纖維化。見圖1。

3.2　各組頸椎間盤髓核組織透射電鏡觀察結果

空白組(第9、18、36周)：髓核細胞內(nèi)細胞器豐富，線粒體數(shù)量較多，呈橢圓形，基本無腫脹，雙層膜及嵴結構清晰，嵴呈同心圓或縱形排列且密集清晰，細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，細胞周圍可見分泌的粘多糖，罕見線粒體的腫脹或空泡樣變性，見圖2。

圖2　空白組髓核細胞(第9、18、36周)

實驗組與對照組(第9周)：髓核細胞線粒體數(shù)量減少，近圓形，腫脹，嵴變短或消失，排列紊亂，結構模糊，嵴溶解呈絮狀物沉積。髓核中活性軟骨細胞旁出現(xiàn)退變細胞，核膜皺縮，細胞質(zhì)濃縮。見圖3。

圖3　實驗組與對照組髓核細胞(第9周)

實驗組(第18、36周)：線粒體數(shù)量增多，腫脹較前消退，形態(tài)基本恢復橢圓形桿狀，嵴、膜結構變清晰。見圖4。

圖4　實驗組(第18、36周)

對照組(第18、36周)：線粒體數(shù)量依舊較少，腫脹變形，嵴、膜結構模糊，出現(xiàn)大量大小不等的空泡，溶酶體明顯增多，可見“髓鞘樣”小體，出現(xiàn)大量嚴重退變細胞。見圖5。

圖5　對照組(第18、36周)

3.3　體視學參數(shù)計量結果

見表1。

表1　予造模后藥物干預后，對

注：與對照組比較，※P<0.001。

4討論

本實驗造模方法采用大鼠頸椎動靜力平衡失調(diào)模型，通過破壞大鼠頸椎周圍肌群，使其穩(wěn)定性喪失，從而加速椎間盤退變，間接造成椎間盤損傷，此方法來源于Ariga[6]所使用的實驗方法。但是由于此方法造成椎間盤退變?yōu)榉e累漸進的損傷過程，要求對大鼠進行較長時間觀察，所以在本實驗中時間最長的一組為36周。

椎間盤退變隸屬于中醫(yī)學“痹證”“筋傷”范疇，中醫(yī)學認為本病病因常與肝腎不足、氣血虧虛有關。通常是虛實夾雜而至，當人體正虛或外傷致瘀時，趁勢而入，彼此互為影響，合而為病。全國名老中醫(yī)經(jīng)驗方溶髓方為李桂文教授的經(jīng)驗方，經(jīng)過長期的臨床使用及觀察，其有效性及安全性得到了廣大患者的認可。該方以“益氣活血、通絡化瘀、表里兼顧、臟腑同治、整體調(diào)攝”的原則為主，依據(jù)中醫(yī)學“君臣佐使”的方劑原則，按上述治療頸椎病的治療原則，結合李教授多年用藥經(jīng)驗，溶髓方組方而成。該方具有祛瘀通絡、行氣活血、滋養(yǎng)肝腎、散結止痛的功效。方中使用當歸、白芍、赤芍之味，乃遵循“治風先治血,血行風自滅”之法，以達活血化瘀，疏達經(jīng)絡之效，使氣血生化有源；又用乳香、沒藥、田七、香附活血化瘀，使血得補而不滯，并能消腫止痛；以五加皮、川續(xù)斷補益肝腎、強筋骨、兼祛風濕，使正盛則邪自祛，牛膝、川續(xù)斷合用使氣血得以生化，強筋骨止疼痛；秦艽、延胡索可除周身痹痛；另加雞血藤使化瘀之力倍增[7]；用甘草理氣健脾，防滋補藥滋膩礙胃，并調(diào)和諸藥。以上諸藥合用，可達通經(jīng)絡、行氣血、益肝腎、止痹痛之效，可使瘀去壅解，經(jīng)絡氣血暢達，標本兼治而除痹證之目的。

參考文獻

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[7]黃余亮.腰椎間盤突出癥診療思路初探[J].河南中醫(yī),2011,31(7):759-761.

(收稿日期：2015-07-29)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

基金項目：廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥科技專項課題(GZKZ1128)。