腺嘌呤致慢性腎功能衰竭大鼠CTGF、FN的實(shí)驗(yàn)研究

★ 閆淵 馬曉燕 崔崢 (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科教研室 沈陽(yáng)110032)

慢性腎衰竭(chronic renal failure CRF)為各種慢性腎臟病持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)局。它是以代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)及酸堿代謝失衡和全身各系統(tǒng)癥狀為表現(xiàn)的一種臨床綜合征［1］。腺嘌呤大鼠腎衰模型雖然早已用于CRF的研究當(dāng)中，但是仍很少有從結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)和纖維蛋白(fibronectin FN)的角度來(lái)探討其作用機(jī)理，而CTGF、FN及其相關(guān)研究已經(jīng)成為目前防治臟器纖維化的熱點(diǎn)。因此如以CTGF和FN為切入點(diǎn)，觀察其在CRF大鼠中的表達(dá)分布，將為腎纖維化的病理研究和防治提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 主要藥物及試劑 腺嘌呤25g/瓶，美國(guó)Amresco公司生產(chǎn);兔抗大鼠CTGF、FN、SABC法免疫組化試劑盒，購(gòu)自武漢博士德。

1．2 動(dòng)物模型建立及分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只(體重180±20g)，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2010－0001。按體重層次隨機(jī)抽取20只為正常組，余下大鼠為模型組。各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組按每只大鼠200mg/(kg·d)的腺嘌呤灌胃［2］，每日1次，正常組以等量NaCl溶液灌胃，連續(xù)灌胃4周，在造模期間因灌胃手法不當(dāng)，誤傷肺組織而導(dǎo)致正常組大鼠死亡1只，腺嘌呤組大鼠死亡2只。

1．3 標(biāo)本收集 各組大鼠分別于第4周后處死，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血化驗(yàn)?zāi)I功能;全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN);取左側(cè)部分腎組織用4%多聚甲醛固定，其余腎組織分別置于PC管中，液氮保存。腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為4～5μm)后常規(guī)HE染色，OLMPUS顯微鏡觀察各組腎組織病理變化并拍照。

1．4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CTGF、FN的表達(dá) 免疫組化SABC法染色，一抗用兔抗大鼠CTGF、FN抗體，二抗用相應(yīng)羊抗鼠抗體(工作濃度按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制為1∶100)染色呈棕褐色或棕黃色者為陽(yáng)性染色，OLMPUS顯微鏡觀察每張切片并隨機(jī)選取5個(gè)視野，用捷達(dá)801圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，檢測(cè)視野內(nèi)免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值，測(cè)得組織細(xì)胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用(ˉx±s)表示，應(yīng)用SPSS17．0軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組大鼠腎組織HE染色結(jié)果 在10倍鏡下觀察兩組大鼠腎組織的病理學(xué)改變，正常組的腎臟皮質(zhì)，腎小球結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小，血管球與腎小球囊腔的比例正常，髓質(zhì)，近端小管與遠(yuǎn)端小管的管壁薄厚、管腔大小正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組的腎臟皮質(zhì)，腎小球結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小不正常，血管球萎縮、腎小球囊腔變大，比例失調(diào)，近端小管與遠(yuǎn)端小管的管壁薄厚不勻、腫脹，管腔大小不一，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠SCr、BUN檢測(cè)結(jié)果(ˉx±s)

表2 各組大鼠CTGF、FN水平的比較(ˉx±s)

圖1 各組大鼠腎組織HE染色

圖2 各組大鼠CTGF表達(dá)

圖3 各組大鼠FN表達(dá)

2．2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清Scr及BUN的比較 在造模后4周，腺嘌呤組的SCr和BUN明顯升高，與正常組比較腺嘌呤組的SCr、BUN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。詳見(jiàn)表1。

2．3 兩組大鼠CTGF、FN的表達(dá) 造模4周后，正常組CTGF、FN表達(dá)不明顯，而腺嘌呤組腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核中CTGF、FN表達(dá)增加(P＜0.01)。細(xì)胞中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(見(jiàn)表2，圖2、3)。

3 討論

用腺嘌呤灌胃的大鼠腎衰竭模型，我國(guó)主要用于CRF及腎間質(zhì)纖維化的研究。周小舟等［3］通過(guò)觀察灌胃21d后大鼠的SCr、BUN、血漿總蛋白、腎比重、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶等指標(biāo)提出腺嘌呤大鼠CRF的機(jī)理可能為其代謝產(chǎn)物尿酸結(jié)晶刺激、阻塞而損傷腎小管及間質(zhì)導(dǎo)致其功能減退;耿靜［4］通過(guò)復(fù)制鄭平東教授的慢性腎衰模型，并通過(guò)測(cè)定SCr、BUN及24h尿蛋白定量和顯微鏡觀察腎組織的病理變化，進(jìn)一步證實(shí)腺嘌呤按體重灌胃給藥可達(dá)到CRF的造模要求并且結(jié)果穩(wěn)定、可控，為臨床常用一些溫補(bǔ)腎陽(yáng)之品治療CRF患者提供了理論依據(jù)。因此本實(shí)驗(yàn)采用腺嘌呤腎病模型，造模4周后模型組SCr、BUN明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，肉眼可見(jiàn)似人類的“大白腎”，由此可知腺嘌呤已成功復(fù)制出CRF大鼠腎衰竭模型。現(xiàn)研究表明CTGF作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF－β1的下游反應(yīng)元件，在腎纖維化中起到很大的作用，尤其是在原位雜交的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，正常腎組織中僅有少量CTGFmRNA表達(dá)。在一些伴有細(xì)胞增殖、基質(zhì)沉積的腎小球炎癥及小管間質(zhì)損傷疾病中，CTGFmRNA表達(dá)明顯增高，更加證明了CTGF在腎纖維化病程中的作用［5－6］。FN是一種具有較強(qiáng)細(xì)胞粘附活性的高分子糖蛋白，在正常腎組織中主要分布于腎小球系膜區(qū)，是腎組織內(nèi)的固有成分。在腎硬化的研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者皆發(fā)現(xiàn)ECM的各種成分中以FN的反應(yīng)最為迅速而持久，先于膠原W、膠原V和層粘連蛋白。如張?jiān)露穑?］的研究表明，在腎小球炎癥早期FN迅速出現(xiàn)，中、后期亦維持高水平，后期W型膠原才明顯增多，提示FN是一種始動(dòng)因素，局部FN和膠原的堆積及其強(qiáng)烈的化學(xué)趨化性，是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及腎小球硬化形成的重要基礎(chǔ)。FN的增多是膠原蛋白沉積的必要條件，F(xiàn)N的持續(xù)增加，加快了腎臟纖維化和硬化的速度。本實(shí)驗(yàn)中腺嘌呤組的CTGF、FN的表達(dá)明顯增加(P＜0．01)，提示腺嘌呤灌胃制作的大鼠腎衰模型是通過(guò)CTGF和FN的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，從而為中醫(yī)藥治療CRF提供新靶點(diǎn)。

［1］陳灝珠，鐘南山，陸再英．內(nèi)科學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2014:524－532．

［2］鄭平東，朱燕俐，丁名城，等．用腺嘌呤制作慢性腎功能衰竭動(dòng)物模型［J］．中華腎臟病雜志，1989，5(6):342－344．

［3］周小舟．腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的機(jī)理研究［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1997，2(17):54－57．

［4］耿靜．腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的實(shí)驗(yàn)研究［J］．河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，3(23):24－25．

［5］MurphyM，GodsonC，CanonS，et al．Suppression subtractive hybridization identifies high glucose levels as a stimulus for expression of connective tissue growth factor and other genes in human mesangial Cells［J］．Biol Chem，1999，274:5 830．

［6］WahabNA，Yevdokimova N，Weston BS，et al．Role of connective tissue growth Factor in the pathogensis of diabetic nephropathy［J］．Bioehem J，2001，359:77．

［7］張?jiān)露穑w維連接蛋白在腎小球硬化過(guò)程中的演變情況觀察［J］．中華病理雜志，1987，16(1):36．