貝那普利與氯沙坦對糖尿病大鼠的心肌保護作用

周　煜，熊世熙

貝那普利與氯沙坦對糖尿病大鼠的心肌保護作用

周煜，熊世熙

摘要：目的觀察貝那普利與氯沙坦對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡、纖維化的干預效果，探討兩者對糖尿病大鼠心肌保護的作用機制。方法將40只SD大鼠隨機分為空白對照組(n=10)和糖尿病模型組(n=30)，糖尿病模型組用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建模，成功后再隨機分為糖尿病對照組(n=10)、貝那普利治療組(n=10)和氯沙坦治療組(n=10)。貝那普利治療組給予貝那普利10 mg/(kg·d)灌胃，氯沙坦治療組給予氯沙坦20 mg/(kg·d)灌胃，糖尿病對照組和空白對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃。給藥9周后，觀察各組心肌細胞凋亡、心肌組織Fas蛋白表達，Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量，血清轉化生長因子-β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)蛋白表達的變化。結果與空白對照組比較，糖尿病對照組血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的含量明顯增多(P<0.05)，Fas蛋白表達率、凋亡指數明顯升高(P<0.05)，心肌細胞凋亡明顯增多；Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯增多(P<0.05)，存在間質纖維化，同時TGF-β1、TIMP-1蛋白表達增多(P<0.05)，MMP-1表達減少(P<0.05)。與糖尿病對照組比較，貝那普利治療組和氯沙坦治療組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量明顯減少(P<0.05)，TGF-β1、TIMP-1蛋白表達減少(P<0.05)，MMP-1表達增多(P<0.05)；Fas蛋白表達率、凋亡指數明顯降低(P<0.05)，貝那普利治療組AngⅡ的含量明顯減低(P<0.05)，氯沙坦治療組AngⅡ的含量升高但差異無統計學意義。貝那普利治療組與氯沙坦治療組組間Fas蛋白表達率、凋亡指數及各項纖維化指標比較差異無統計學意義。結論糖尿病大鼠的心肌細胞凋亡明顯增加，間質纖維化增加。貝那普利和氯沙坦均能抑制心肌細胞的凋亡和間質纖維化。

關鍵詞：糖尿病；貝那普利；氯沙坦；血管緊張素Ⅱ；細胞凋亡；心肌纖維化

糖尿病性心肌病，雖然其發病機制尚未完全研究明確，但是可以觀察到存在著纖維化和心肌細胞凋亡，這能夠較好的解釋糖尿病心肌病的臨床現象。本實驗在成功建立糖尿病大鼠模型后，分別應用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)貝那普利、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)氯沙坦藥物進行干預，探討其對心肌細胞凋亡和纖維化的影響及可能的作用機制。

作者單位：武漢大學中南醫院(武漢 430071)

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司產品，AngⅡ放射免疫分析試劑盒購自北方生物技術研究所，兔抗鼠Fas蛋白多克隆抗體為美國Santa Cruz公司。

1.1.2動物分組健康雄性大鼠40只，體重205 g～245 g(225 g±10 g)，購自武漢大學動物實驗中心。隨機分為正常對照組(10只)和糖尿病組(30只)，適應性喂養5 d。5 d后，糖尿病組禁食12 h，在左下腹腹腔內一次性注射STZ(用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液溶解，pH=4.5)50 mg/kg。同時，正常對照組注射同等劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。3 d后斷尾，測血糖值及尿糖定性。如若空腹血糖持續3 d≥13.8 mmol/L，尿糖定性≥+++，大鼠出現“三多一少”癥狀，則表示模型建立成功。隨后隨機分為糖尿病對照組、貝那普利治療組、氯沙坦治療組，每組10只，4組大鼠以同樣的方式飼養10周。

1.2方法

1.2.1標本采集無菌條件下心臟取血，常規生化檢測血糖、總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)，并取部分心肌組織10%甲醛固定。

1.2.2AngⅡ檢測放射免疫法檢測心肌局部AngⅡ含量，取新鮮的左室心肌100 mg，采用AngⅡ放射免疫試劑盒，按照說明書測定AngⅡ含量。

1.2.3心肌組織Fas蛋白表達率檢測采用SP免疫組化法檢測，10%甲醛固定24 h后石蠟包埋切片，抗原染色，按染色試劑說明書進行操作。顯微鏡下在陽性表達區域隨機選取5個無重疊視野，取OD值的平均值作為各標本的蛋白表達。

1.2.4原位心肌細胞凋亡檢測取左心室前壁心肌制作組織切片，使用原位細胞凋亡試劑盒檢測凋亡細胞切片。光鏡下隨機選擇5個視野，計算視野中每300個有核細胞中陽性細胞占的百分比，取平均值作為凋亡細胞陽性指數(AI)。

1.2.5其他Ⅰ型、Ⅲ型膠原，血清轉化生長因子-β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)蛋白表達檢測采用免疫組化法。取左心室心肌組織甲醛固定，石蠟包埋，切片，抗原染色后于顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5個視野測OD值取平均值。

2結果

2.1模型建立30只糖尿病大鼠均建模成功，實驗過程中糖尿病大鼠與正常對照組相比，活動減少，多尿、多飲、多食。在整個實驗期間所有大鼠均未使用抗生素及降糖藥物。HE染色可見糖尿病心肌組織有灶性壞死，纖維間可見成纖維細胞活躍，纖維紊亂，心肌間細小動脈血管壁明顯增厚，有纖維化和玻璃樣變性，血管腔狹窄。

2.24組大鼠血糖、TG、TC比較與空白對照組相比，糖尿病組大鼠血糖、TG、TC水平均增高(P<0.05)；貝那普利組、氯沙坦組血糖、TG、TC水平與糖尿病對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　4組大鼠血糖、血脂比較(±s) 　mmol/L

2.34組大鼠心肌組織AngⅡ、AI、Fas蛋白表達率的比較與空白對照組比較，糖尿病對照組AngⅡ含量、Fas蛋白表達率、凋亡指數均顯著增高(P<0.05)；與糖尿病對照組相比，貝那普利治療組Fas蛋白表達率、凋亡指數均顯著降低(P<0.05)，AngⅡ含量明顯降低(P<0.05)，氯沙坦治療組AngⅡ含量升高但差異無統計學意義，Fas蛋白表達率及凋亡指數顯著性降低(P<0.05)。氯沙坦治療組Fas蛋白表達率及凋亡指數稍高于貝那普利治療組，差異無統計學意義。詳見表2。

表2　4組大鼠心肌組織AngⅡ、AI及Fas蛋白表達率的比較(±s)　%

2.44組大鼠心肌纖維化指標表達的比較與空白對照組比較，糖尿病對照組TGF-β1和TIMP-1蛋白表達增多(P<0.05)，膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型含量增多(P<0.05)，存在明顯的間質纖維化，MMP-1表達減少(P<0.05)。與糖尿病對照組比較，TGF-β1和TIMP-1蛋白表達減少(P<0.05)，膠原Ⅰ、Ⅲ含量減少(P<0.05)，MMP-1表達增多(P<0.05)。氯沙坦治療組纖維化指標稍好于貝那普利治療組，但差異無統計學意義。詳見表3。

表3　4組大鼠心肌纖維化指標表達的比較(±s)

3討論

很多研究表明糖尿病心肌病為心肌的一種特異性病變[1]。糖尿病心肌病發生發展過程尚不明確，影響因素眾多，如物質代謝紊亂、腎素-血管緊張素(RAS)系統激活、氧化性損傷、心肌凋亡、纖維化等[2]。許多動物實驗已表明，在高血糖狀態下心臟局部的AngⅡ含量明顯增加。心臟局部AngⅡ參與了糖尿病心肌病的心肌重塑過程[3]。糖尿病心肌病大鼠血漿中及心臟局部AngⅡ含量都明顯升高。有實驗表明即使將血漿AngⅡ控制在正常范圍內時也不能阻止心肌病變的進展。這提示在糖尿病心肌病變發生中起主要作用是心肌局部AngⅡ。因此可以認為，循環中AngⅡ主要導致外周血管收縮，醛固酮分泌增多，水鈉潴留[4]。心臟局部AngⅡ則是由自分泌和旁分泌等方式釋放近距離作用于附近的心肌組織，導致心肌細胞的肥大、凋亡及間質的纖維化而參與心室重塑[5]。心肌重塑包含兩個方面的內容，一方面是心肌細胞的肥大、壞死和凋亡，另一方面則是間質的纖維化。Frustaci等[6]研究發現AngⅡ可誘導產生心肌氧化性損傷，導致心肌細胞凋亡和壞死；糖尿病病人心肌細胞的凋亡發生率則遠高于心肌細胞的壞死發生率。與單純糖尿病比較糖尿病并發高血壓時心肌細胞凋亡發生率并不增加。由此可知，在糖尿病心肌病病人中AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡在心肌重塑中發揮著重要作用。Fas，即CD95，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，而FasL為Fas的特異性配體。Fas-FasL是非常重要的外源性細胞凋亡信號通路。許多活化的免疫細胞會在細胞表面表達FasL分子，與此同時相應的體內多種細胞在特定情況下也會在細胞膜上表達Fas分子，FasL通過作用于Fas分子，啟動后者細胞內的caspase級聯反應，導致凋亡的發生[7]。許多研究表明Fas-FasL在體內有著廣泛的作用，幾乎存在于人體的所有系統，與多種疾病密切相關，如免疫缺陷疾病、多種自身免疫疾病、肝臟炎癥、糖尿病、移植排斥等，在心臟方面可能參與了急性心肌梗死、心肌炎、心力衰竭等多種心臟疾病中存在的心肌細胞凋亡過程。此外有研究表明心肌細胞自身可以重新合成和釋放Fas，因此更能證明在糖尿病心肌病的進展中Fas-FasL系統參與了心肌細胞的凋亡。

心肌纖維化往往是由于心肌間質蛋白合成增加以及降解的障礙，特別是Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積，可導致心臟擴張、心力衰竭、心律失常、猝死等。有研究表明AngⅡ可以作用于血管緊張素Ⅱ受體(AT1)，導致膠原分泌增加。同時也有不少研究表明AngⅡ還可作用于成纖維細胞等使其合成并分泌TGF-β1。活化的TGF-β1是非常有效的致纖維因子，可以提高心肌基質多種蛋白的分泌(主要是膠原成分)。此外上調TGF-β1的表達，通過增加纖溶酶原激活物抑制物 1(PAI-1)的分泌，抑制MMP的活性，其中MMP-1為膠原酶主要水解Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維，導致Ⅰ型、Ⅲ型膠原堆積，從而產生纖維化[8]。TIMP-1則可以特異性抑制MMP-1，也可以部分反映心肌間質中膠原的代謝情況。

實驗中糖尿病組大鼠的心肌局部AngⅡ含量明顯增加，與此同時細胞凋亡指數升高、Fas蛋白表達率也明顯上升，心肌細胞的凋亡明顯增加。再觀察各項纖維化的相關指標，致纖維化因子TGF-β1表達增加，MMP-1表達減少，TIMP-1表達增加，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維堆積，可見心肌間質纖維化程度是有明顯增加。心肌細胞的凋亡降低了心肌的收縮功能。間質的纖維化則使心室壁變得僵硬、順應性減低從而影響舒張功能。

ACEI類藥物主要作用于RAS系統中血管緊張素轉換酶(ACE)，通過對ACE的抑制，減少AngⅡ的生成。本實驗中貝那普利治療組大鼠與糖尿病對照組比較，血糖、血脂未有明顯改善，心肌局部AngⅡ明顯減少，同時凋亡指數、Fas蛋白表達率降低，各種致纖維因子表達下降，細胞外Ⅰ、Ⅲ膠原減少。ACEI類藥物可通過減少 AngⅡ的生成，抑制糖尿病心肌病大鼠的心室重塑。

ARB類藥物主要作用于AngⅡ的AT1受體，而AngⅡ的大部分生物學效應是通過作用于AT1受體發揮作用的。有研究表明，AT1特異性阻斷劑ARB類藥物可以明顯抑制心臟成纖維細胞前膠原的合成[9]，抑制間質膠原增生，改善心臟微血管基底膜增生。本實驗中氯沙坦治療組大鼠較糖尿病對照組心肌局部AngⅡ含量稍升高，差異無統計學意義，原因可能是循環中的AngⅡ通過AT1介導而在某些組織(如心、腎)中積聚，但這種作用幾乎可完全被AT1受體拮抗劑所阻斷，故來自循環中的AngⅡ減少。氯沙坦治療組大鼠較糖尿病對照組凋亡指數、Fas蛋白表達率降低，各種致纖維因子表達下降；但是較貝那普利治療組凋亡指數及Fas蛋白表達率稍高，各種致纖維因子表達稍低，差異無統計學意義。許多實驗表明AT2在胚胎組織和已死亡的組織中有廣泛表達，但成年體內很少表達。在心肌梗死、心力衰竭及皮膚損傷后又會重新表達，提示在病理情況下，AT2可能參與了組織的修復過程。關于AT2受體的作用還存在爭議，但是用特異性激動劑和拮抗劑的實驗證實AT2-R參與了調節發育、細胞增殖和凋亡[10]，具有一定的抗增殖、致凋亡作用。使用ARB類藥物不僅阻斷了AT1受體介導的心室重塑，但同時心肌局部升高的AngⅡ可以作用于AT2受體，可能發揮了一定的抗增殖、致凋亡作用。本實驗中貝那普利治療組和氯沙坦治療組凋亡指標和纖維化指標差異無統計學意義，有研究表明不同劑量的沙坦類藥物可以逆轉不同程度的纖維化，因此推測可能與實驗中氯沙坦的劑量有一定關系。

研究還發現，人類心臟局部AngⅡ只有約20%來自于ACE途徑，大部分卻是來自胃促胰酶(chymase)生成。在心臟疾病狀態下表現得更為明顯，可能是由于疾病狀態下chymase被病理性激活。本實驗中ARB組大鼠心功能與ACEI組比較無明顯改善，可能是由于人與大鼠的物種差異導致。chymase存在多種同工酶，在人類是α-chymase可以裂解血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)生成AngⅡ，但在大鼠體內是β-chymase，并不能生成AngⅡ，大鼠體內AngⅡ基本上都是通過ACE生成的，因此ACEI類藥物和ARB藥物在實驗中差異不明顯。如果僅從阻斷RAS的角度看，沙坦類藥物優于ACEI類藥物，但是兩類藥物作用的靶點、機制并不完全一樣，兩種藥物同時使用更能獲益，不僅是在抗凋亡還是抗纖維化方面，其具體的機制還有待進一步研究。

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(本文編輯郭懷印)

Cardioprotection of Benazepril and Losartan in Diabetic Rats

Zhou Yu，Xiong Shixi

Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China

Corresponding Author：Xiong Shixi

Abstract：ObjectiveTo explore the possible mechanism of benazepril or losartan improving myocardial interstitial fibrosis and cardiomyocytes apoptosis in diabetic rats.MethodsForty Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into 2 groups，10 as normal control group and the other 30 as diabetic group which were induced by STZ，after the models were constructed successfully，randomly devided into diabetic control group，benazepril treated group，losartan treated group，each contains 10.Following the instruction，benazepril was administrated at the concentration of 10 mg/kg once a day，losartan was administated at the concentration of 20 mg/kg once a day，while in the diabetic control group and the normal control the same volume sodium chloride was administrated.After ten weeks，SP immunohistochemical staining was used to detect the level of Fas.Radioimmunity was used to measure the content of angiotensinⅡ(AngⅡ).Immunohistochemistry was used to measure the levels of typeⅠcollagen，type Ⅲ collagen，transforming growth factor (TGF)-β1， matrix metalloproteinase (MMP)-1， tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)-1 protein.ResultsCompared to the normal control group，the content of AngII increased significantly，the rate of expression of Fas increased significantly，the apoptosis index increased significantly；the expressions of type Ⅰ，type Ⅲ collagen，TGF-β1prptein，TIMP-1 protein also increased significantly，however，the expression of MMP-1 protein decreased significantly.Compared to the diabetic control group，all the indexes were greatly improved in benazepril treated group.In losartan treated group，all the indexes except AngⅡwere greatly improved.ConclusionBenazepril and losartan can improve obviously the myocardial inerstitial fibrosis，cadiocyte apoptosis in diabetic rats.

Key words：diabetes mellitus；benazepri；losartan；angiotensinⅡ；cadiocyte apoptosis；myocardial interstital fibrosis

(收稿日期：2015-04-03)

通訊作者：熊世熙，E-mail：xiongshixi@126.com

中圖分類號：R587.1R255.4

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．010

文章編號：1672-1349(2015)18-2060-04